多拷貝策略構(gòu)建瑞氏木霉外源基因系列表達載體.pdf

1、瑞氏木霉是自然界中廣泛分布的腐生性絲狀真菌，具有良好的分泌多種大分子物質(zhì)降解酶類的能力，用瑞氏木霉作為工業(yè)菌株生產(chǎn)分解不同植物材料的酶類包括纖維素酶、半纖維素酶等，已有多年歷史。瑞氏木霉具有極好的合成蛋白和分泌蛋白的能力，某些高產(chǎn)菌株其胞外纖維素酶的主要成分-外切葡聚糖纖維二糖水解酶Ⅰ的產(chǎn)量可達50mg/L，其中此啟動子為強啟動子。 近年來，瑞氏木霉已作為基因工程宿主菌用于生產(chǎn)外源真核蛋白。瑞氏木霉所具有的優(yōu)良性能促進了對該菌的

2、分子生物學研究和遺傳改造。國內(nèi)對瑞氏木霉的分子生物學研究報導(dǎo)不多，建立性能優(yōu)良、強表達的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是目前深入開展瑞氏木霉分子生物學和遺傳育種研究中迫切需要解決的關(guān)鍵問題。其中利用外切葡聚糖纖維二糖水解酶Ⅰ基因的啟動子在瑞氏木霉中構(gòu)建高效表達載體被廣泛的運用。 在基因工程研究中，影響外源蛋白表達的因素包括基因拷貝數(shù)、啟動子強度以及多拷貝、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、宿主蛋白酶活性等。為了解除葡萄糖阻遏、提高外源蛋白的表達量，本文利用重組PCR

3、缺失瑞氏木霉外切葡聚糖纖維二糖水解酶Ⅰ基因啟動子上的葡萄糖阻遏位點，并對含有CCAAT盒、Ace2結(jié)合位點、XlnR結(jié)合位點等轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合基序的功能區(qū)域采用多拷貝策略進行了改造。 用cbh1全長啟動子(1291bp)構(gòu)建了以gus基因作為報告基因的表達質(zhì)粒pLPTG，并在pLPTG基礎(chǔ)上對cbhl啟動子-1306～-869bp區(qū)域進行缺失突變，構(gòu)建得到質(zhì)粒pCPTG。在pCPTG基礎(chǔ)上對含有CreⅠ結(jié)合位點的-709～-66

4、1bp區(qū)域進行缺失突變，得到缺失質(zhì)?！鱬CPTG。通過分子操作，在重組質(zhì)?！鱬CPTG基礎(chǔ)上插入△pCPTGcbhl啟動子中的-805～-606bp區(qū)不同數(shù)目拷貝序列，構(gòu)建了含該功能區(qū)2、4、6拷貝序列的質(zhì)?！鱬2CPTG、△p4CPTG、△p6CPTG。 將上述6種質(zhì)粒分別與潮霉素抗性質(zhì)粒pAN7-1一起轉(zhuǎn)化瑞氏木霉蛋白酶缺陷株T.reeseiRutC30U4，挑選單個菌落并培養(yǎng)，PCR驗證gus基因是否整合到轉(zhuǎn)化子的染色體上

5、。通過對1200多株轉(zhuǎn)化子進行PCR反應(yīng)，獲得了50株gus基因可能整合到染色體上的轉(zhuǎn)化子。對PCR產(chǎn)物測序結(jié)果證實確實擴增得到為GUS報告基因DNA序列。對其中的6株轉(zhuǎn)化子進行RT-PCR，試驗結(jié)果與預(yù)計結(jié)果相吻合。對6株轉(zhuǎn)化子進行GUS比活測定，結(jié)果顯示T.reeseiP12(pCPTG質(zhì)粒的T.reeseiRutC30U4轉(zhuǎn)化子)的GUS比活是U3-3(pLPTG質(zhì)粒的T.reeseiRutC30U4轉(zhuǎn)化子)的1.34倍，T.re

6、esei△1-2(△pCPTG質(zhì)粒的T.reeseiRutC30U4轉(zhuǎn)化子)GUS比活是U3-3的1.8倍。在此基礎(chǔ)上的多拷貝啟動子轉(zhuǎn)化結(jié)果表明，在-805～-606bp區(qū)4拷貝以內(nèi)，隨著cbhl啟動子拷貝數(shù)的升高，報告基因的表達水平呈上升趨勢，即T.reesei△2-4(△p2CPTG質(zhì)粒的T.reeseiRutC30U4轉(zhuǎn)化子)GUS比活是U3-3的2.1倍，T.reesei△4-3(△p2CPTG質(zhì)粒的T.reeseiRutC30

7、U4轉(zhuǎn)化子)GUS比活是L13-3的2.44倍；但拷貝數(shù)達到6(T.reesei△6-1)時，報告基因表達水平與4拷貝轉(zhuǎn)化子△4-3基本持平。 在乳糖培養(yǎng)基上分別補加乳糖與葡萄糖培養(yǎng)T.reeseiP12與T.reesei△1-2，測定報告基因GUS酶活。測定結(jié)果顯示在補加葡萄糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的T.reeseiP12GUS酶活大幅度下降，僅為補加乳糖培養(yǎng)基所測酶活的40％左右，證實在cbhl啟動子-709～-661bp區(qū)域確實存