馬鈴薯S病毒外殼蛋白的原核表達及其多克隆抗體的制備.pdf

1、本研究的目的是構(gòu)建馬鈴薯S病毒(PVS)外殼蛋白(CP)基因的原核表達載體，實現(xiàn)其高效表達，用表達產(chǎn)物作抗原制備抗血清，進一步獲得純化的抗體(IgG)與酶標記抗體并用于PVS的DAS-ELISA檢測，為組裝PVS的ELISA檢測試劑盒奠定基礎。 以質(zhì)粒pGEM-pvs為模板，經(jīng)PCR擴增獲到了長約890bp的PVS～CP基因條帶。用Ultrafree-DA試劑盒一步離心法回收特異性DNA片段并與T表達載體pBAD/Thio-TO

2、PO連接，連接物轉(zhuǎn)化受體菌TOPO10獲得了Amp抗性菌落。經(jīng)質(zhì)粒電泳檢測、PstⅠ與SphⅠ的單酶切和雙酶切鑒定，篩選到了PVS-CP基因正向插入載體的陽性克隆，相應的重組質(zhì)粒命名為pBAD-SCP。DNA測序結(jié)果表明882bp的不含終止密碼的PVS-CP基因序列插入載體的方向正確、密碼子的閱讀正確，即成功構(gòu)建了PVS-CP基因的原核表達載體。 用阿拉伯糖誘導工程菌TOPO10(pBAD-SCP)中外源基因的表達，獲得了預期的

3、49kDa融合蛋白。誘導研究表明在SOB培養(yǎng)基中融合蛋白的表達量高于LB培養(yǎng)基，經(jīng)優(yōu)化的表達條件為：37℃，在SOB培養(yǎng)基中用0.2％阿拉伯糖誘導4h。光密度掃描結(jié)果表明該融合蛋白在細菌總蛋白中占的比例為27％。 用溶菌酶裂解菌體，提取細菌總蛋白，SDS-PAGE顯示表達的融合蛋白主要以包涵體的形式存在。用8M尿素溶解包涵體，經(jīng)鎳離子親和層析純化，獲得了高純度的目的蛋白。對純化后的變性蛋白進行了透析復性與柱上復性處理，獲得了兩種

4、復性蛋白。 分別用純化得到的變性蛋白、透析復性獲得的蛋白與柱上復性獲得的蛋白作抗原免疫家兔，制備出了抗血清。瓊脂糖雙向擴散顯示三種抗血清與抗原(融合蛋白)均能形成明顯的沉淀線，即獲得了該蛋白的特異性抗血清，用變性蛋白制備的抗血清的效價為1：16，其余兩種為1：32。間接ElISA測定表明復性蛋白抗血清的效價分別為1：12800和1：6400，而變性蛋白抗血清的效價為1：1600。兩種測定方法的結(jié)果都表明復性蛋白抗血清的效價高于變

5、性蛋白的抗血清。 先用飽和(NH<,4>)<,2>SO<,4>進行鹽析，然后用Protein G親和層析柱純化，獲得了高純度抗體(IgG)。用戊二醛一步法對純化的抗體進行標記，獲得了IgG的堿性磷酸酶標記物。用純化的IgG與酶標抗體(IgG-AP)對感染PVS的幼苗進行DAS-ELISA檢測，結(jié)果呈陽性，健康的幼苗則呈陰性，結(jié)果表明獲得了PVS的特異性多克隆抗體與酶標記抗體。 本研究為通過基因工程途徑大量制備PVS抗體、