人類基因hUBC16和GPx7的克隆與功能研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模的cDNA克隆與測(cè)序工作積累了大量的全長(zhǎng)基因庫(kù)。借助大量的生物信息學(xué)手段，我們?cè)噲D從這些庫(kù)中去篩選可能與重要的生理途徑及人類疾病密切相關(guān)的基因進(jìn)行研究。在此基礎(chǔ)上我們篩選到了兩條感興趣的基因分別進(jìn)行研究，它們是hUBCl6和GPx7。 hUBCl6的cDNA全長(zhǎng)2252bp，編碼一個(gè)162個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。蛋白序列分析顯示hUBCl6具有一個(gè)重要的功能結(jié)構(gòu)域：泛素結(jié)合酶(Ubiquitin-conjugatinge

2、nzyme，UBC)結(jié)構(gòu)域。且信息學(xué)分析推測(cè)hUBCl6與擬南芥(Arabidopsisthaliana)UBCl6高度同源，可能為人類泛素結(jié)合酶蛋白家族的新成員。泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugatingenzyme)又簡(jiǎn)稱為E2，是泛素系統(tǒng)的主要部件之一，作為一個(gè)中間橋梁般的角色，它從泛素活化酶(ubiquitin-activatingenzyme，或簡(jiǎn)稱Е1)接受泛素，和泛素形成了高能硫脂鍵，再把泛素交給下游的部件：泛

3、素連接酶(ubiquitinligase，或簡(jiǎn)稱E3)或直接底物，底物被泛素修飾后，將被降解，或生命活動(dòng)受到調(diào)節(jié)。 經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)hUBCl6可能定位于細(xì)胞核中，用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blastn,blastp等生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)hUBCl6的蛋白C端具有兩個(gè)核定位信號(hào)，在102位的半胱氨酸可能是它的酶活中心，并且用體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了酶活中心的確是102位的Cys；亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明hUBCl6主要定位于細(xì)胞核中與生物信息

4、學(xué)預(yù)測(cè)的結(jié)果一致，我們也用實(shí)驗(yàn)證實(shí)了活性中心對(duì)于hUBCl6的正確定位發(fā)揮著與核定位信號(hào)同等重要的作用；酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)篩選出一些潛在的可能與hUBCl6相互作用的蛋白：ERALl：UBElv2；RNFl67；KIAAl972；RNF8。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，hUBCl6的上調(diào)表達(dá)會(huì)促使處于細(xì)胞周期S期的細(xì)胞比例增加，而下調(diào)hUBCl6的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致處于細(xì)胞周期S期的細(xì)胞比例減少，表明hUBCl6對(duì)細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，但其促進(jìn)細(xì)胞周期的分

5、子機(jī)理仍然還不清楚，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的深入研究。 谷胱甘肽過氧化物酶(GPXs)可以保護(hù)細(xì)胞免受由呼吸代謝產(chǎn)生的活性氧自由基的氧化傷害，也具有與細(xì)胞周期、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控相關(guān)的功能，我們克隆到一個(gè)人cDNA序列，經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其編碼一個(gè)長(zhǎng)187個(gè)氨基酸的蛋白具有GSHPx的結(jié)構(gòu)域和BtuE的基序，并且通過基因和編碼蛋白的結(jié)構(gòu)信息分析表明它就是NPGPx基因。通過生物信息學(xué)EST分析，以及組織表達(dá)譜分析，證實(shí)它在正常組織中廣譜

6、表達(dá)，具有腫瘤組織表達(dá)特異性。我們克隆了全長(zhǎng)GPx7的cDNA，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)與亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明GPx7主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)篩選出一些潛在的可能與GPx7相互作用的蛋白：RANandEIF3S12。序列分析發(fā)現(xiàn)RAN是原癌基因Ras超家族中的成員，對(duì)細(xì)胞增殖起到促進(jìn)作用，而EIF3S12目前僅知道它是真核轉(zhuǎn)錄促進(jìn)因子3的一個(gè)亞基，可能參與真核基因的轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)證明GPx7的上調(diào)表達(dá)會(huì)使細(xì)胞周期G1期細(xì)胞所占比例增加

7、，同時(shí)S期細(xì)胞所占比例急劇減少，此外同時(shí)上調(diào)GPx7與RAN的結(jié)果發(fā)現(xiàn)比單獨(dú)上調(diào)表達(dá)RAN而引起的S期細(xì)胞增加比例要小，上述結(jié)果看出GPx7可能對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程具有抑制作用。 綜合而言，我們克隆了一條新的人類泛素結(jié)合酶基因hUBCl6和一條已報(bào)道的谷胱甘肽過氧化物酶基因GPx7并對(duì)它們的功能進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示hUBCl6與GPx7都與細(xì)胞周期有關(guān)，hUBCl6可能對(duì)細(xì)胞增殖起到促進(jìn)作用，而GPx7的上調(diào)可能對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程起到抑制