含低氧誘導(dǎo)啟動(dòng)子和質(zhì)粒分配序列的革蘭氏陰性菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、在該論文工作中,利用質(zhì)粒pSC101的par位點(diǎn)(partiton region)與透明顫菌血紅蛋白基因啟動(dòng)子(P<,vgb>)以及透明顫菌血紅蛋白基因操縱子(vgb)分別組合,在大腸桿菌質(zhì)粒pKK223-3的基礎(chǔ)上構(gòu)建了四個(gè)各具特點(diǎn)的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒:pKVp(P<,vgb>)、pKVpP(P<,vgb>、par region)、pKVpV(P<,vgb>、vgb operon)、pKVpPV(P<,vgb>、par region、v

2、gb operon)可滿足大腸桿菌中蛋白表達(dá)的不同要求;利用優(yōu)化后的同源重組技術(shù),將E. coli JM83/E.coli JM101分別改造成為整合有透明顫菌血紅蛋白基因操縱子的重組菌E. coli VI/E.coli Ⅶ;通過將透明顫菌血紅蛋白基因啟動(dòng)子以及透明顫菌血紅蛋白基因操縱子與革蘭氏陰性菌廣泛宿主載體pBBRlMCSl和pBBRlMCS2組合,構(gòu)建了兩個(gè)抗性不同的革蘭氏陰性菌廣泛宿主低溶氧誘導(dǎo)表達(dá)載體.結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道,該工作利

3、用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)、甲苯雙加氧酶(TOD)、聚羥基丁酸合成酶(phaCAB)作為目的表達(dá)蛋白,對(duì)該系統(tǒng)中不同的表達(dá)載體進(jìn)行了檢測(cè).搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在所有的表達(dá)系統(tǒng)中,透明顫菌血紅蛋白在限氧條件下的表達(dá)量要高于富氧條件下.在整合有vgb操縱子的重組大腸桿菌Ⅵ/Ⅶ中,限氧條件下VHb的表達(dá)量大約是相同條件下重組菌E. coli JM83(pKVpPV)的1/4.同時(shí),增強(qiáng)型綠色熒光蛋白和甲苯雙加氧酶的介入并沒有改變這兩種條件下

4、透明顫菌血紅蛋白表達(dá)量的比例.含有質(zhì)粒pKVp-E(P<,vgb>,egfp)或pKVpP-E(P<,vgb>,par,egfp)的重組大腸桿菌在24小時(shí)培養(yǎng)中,在厭氧、無(wú)抗生素條件下增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的表達(dá)量至少是相對(duì)應(yīng)的在富氧條件下的兩倍.在表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白時(shí)檢測(cè)到,與tac啟動(dòng)子相比,P<,vgb>不需要化學(xué)誘導(dǎo)劑,而且當(dāng)兩者均處于誘導(dǎo)狀態(tài)時(shí),后者表現(xiàn)出更高的表達(dá)強(qiáng)度和誘導(dǎo)效率,后者是前者的1.7倍.重組菌E.coli JM