表皮葡萄球菌耐藥特征及其PIA上游調控子與亞-MIC紅霉素影響其生物膜形成的關系研究.pdf

1、目的：
　　本研究以sub-MIC ERY為干預因素，以臨床分離不同ERY耐藥表型的S.epidermidis菌株為研究對象，首先進行生物膜形成能力的檢測和亞抑菌濃度ERY對其生物膜形成的影響，并進一步分析其與細菌ERY耐藥特征的關系，同時考察菌株PIA合成、icaA基因的轉錄以及其上游調控因子sarA、ica及LuxS/AI-2群體感應系統(tǒng)的變化情況，以明確ERY耐藥特征及PIA上游調控因子與sub-MIC ERY影響S.epi

2、dermidis菌株生物膜形成的可能關系。
　　方法：
　　第一部分 亞抑菌濃度紅霉素對臨床分離表皮葡萄球菌生物膜形成的影響及其與細菌紅霉素耐藥表型的關系研究
　　1.1、對臨床分離菌株最小抑菌濃度（MIC值）的測定
　　采用“標準瓊脂平板倍比稀釋法”，以標準菌株S.aureus ATCC29213TM作為質控菌株，結果判讀參照“2010版實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Stan

3、dards Institute，CLSI)”的標準進行，測定96株臨床分離S.epidermidis菌株的MIC值。
　　1.2、細菌生物膜形成的觀察方法
　　采用結晶紫染色法觀察1/4 MIC ERY對S.epidermidis菌株生物膜形成的影響并統(tǒng)計分析1/4 MIC ERY作用下S.epidermidis菌株生物膜形成能力的改變與ERY耐藥表型的相關性。
　　根據(jù)實驗室前期研究結果和文獻報道，課題設定臨床分離S

4、.epidermidis菌株的生物膜OD值≥2倍標準菌株S.epidermidis ATCC12228TM的生物膜OD值，則認為該菌株具有生物膜形成能力。1/4 MIC ERY對臨床分離S.epidermidis菌株生物膜形成的影響分為誘導、抑制或者不受影響三種類型，其區(qū)分標準如下：t檢驗比較各菌株ERY組與TSB對照組的生物膜OD值是否存在統(tǒng)計學差異。如果p＜0.05且ERY組的OD值大于TSB組的OD值，則認為該菌株生物膜形成發(fā)生了

5、誘導現(xiàn)象;如果p＜0.05且ERY組的OD值小于TSB組的OD值，則認為該菌株生物膜形成發(fā)生了抑制現(xiàn)象;如果p＞0.05，則認為該菌株生物膜形成未發(fā)生變化。
　　第二部分 臨床分離表皮葡萄球菌大環(huán)內酯類耐藥基因分布及1/4最小抑菌濃度紅霉素作用下erm基因的轉錄表達研究
　　2.1、聚合酶鏈式反應法(PCR)鑒定臨床分離菌株大環(huán)內酯類耐藥基因
　　采用PCR法檢測96株臨床分離S.epidermidis菌株中ermA，

6、ermB及ermC基因的分布情況，并對其中分布最廣的ermC基因進行序列測定和同源性分析。
　　2.2、1/4最小抑菌濃度紅霉素作用下實驗菌株ermC基因轉錄表達水平的時間-效應考察
　　采用real time RT-PCR方法，考察與1/4 MIC ERY共同孵育0.5 h、2h、6h、12h和24 h，實驗菌株SH04和SH10的ermC基因的轉錄表達水平受其影響的情況，分析ermC基因的轉錄表達水平變化與1/4 MIC

7、 ERY對實驗菌株生物膜形成影響的可能關系。
　　2.3、ermC基因轉錄表達水平與生物膜形成能力的相關性分析
　　根據(jù)ermC基因轉錄表達的時間-效應實驗結果，隨機抽取生物膜形成受1/4 MICERY抑制、誘導和不受其影響三種表型的菌株各8-9株，采用real time RT-PCR方法，考察與1/4 MIC ERY共同孵育2h，各菌株ermC基因的轉錄表達情況，分析該因素與1/4 MIC ERY作用下S.epidermi

8、dis菌株生物膜OD值與無ERY作用下S.epidermidis菌株生物膜OD值的比率之間的可能關系。
　　結果：
　　第一部分 亞抑菌濃度紅霉素對臨床分離表皮葡萄球菌菌株生物膜形成的影響及其與細菌紅霉素耐藥表型的關系研究
　　1、臨床分離表皮葡萄球菌菌株的紅霉素耐藥情況
　　96株臨床分離S.epidermidis中，85株為ERY耐藥(MIC≥8 mg/L)菌株，耐藥率為88.5％。其中15株MIC值在8～1

9、28 mg/L范圍內，70株MIC值≥128 mg/L。
　　2、1/4最小抑菌濃度紅霉素對臨床分離表皮葡萄球菌生物膜形成的影響
　　結果顯示，96株臨床分離S.epidermidis菌株均可形成生物膜。生物膜形成受1/4 MICERY影響的菌株共27株，且都是ERY耐藥菌株。其中4株生物膜形成發(fā)生了抑制現(xiàn)象(p＜0.05)，23株生物膜形成發(fā)生了誘導現(xiàn)象(p＜0.05)。生物膜誘導菌株中，18株的生物膜誘導程度在1.11-

10、2.0倍之間，5株的生物膜誘導程度大于2倍。其余58株ERY耐藥株及11株ERY敏感株的生物膜形成均未受1/4 MIC ERY的明顯影響。統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，1/4 MIC ERY對臨床分離S.epidermidis ERY耐藥株和敏感株生物膜形成的影響不同，差異有統(tǒng)計學意義(x2=4.861，p=0.031)，提示1/4 MIC ERY作用下，臨床分離S.epidermidis菌株生物膜形成與菌株的ERY耐藥表型相關。
　　3、體外

11、誘導耐藥結果及1/4最小抑菌濃度紅霉素對誘導耐藥前后菌株生物膜形成的影響
　　11株臨床分離ERY敏感S.epidermidis菌株均被成功誘導成ERY耐藥菌株，誘導耐藥后的MIC值分布在16～256μg/ml范圍。平行考察1/4 MIC ERY作用下，11株ERY敏感S.epidermidis菌株及其誘導耐藥后菌株生物膜的形成情況，結果顯示:誘導耐藥后S.epidermidis菌株SH22、SH51和SH67的ERY組生物膜OD

12、值與其對照組比較，明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);誘導耐藥后S.epidermidis菌株SH40、SH46、SH52和SH77的ERY組生物膜OD值與其對照組比較，明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。原11株ERY敏感S.epidermidis菌株ERY組生物膜OD值與其對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。
　　第二部分 臨床分離表皮葡萄球菌大環(huán)內酯類耐藥基因分布及1/4最小抑菌濃度紅霉素作用下er

13、m基因的轉錄表達研究
　　1、96株臨床分離表皮葡萄球菌ermA、ermB及ermC基因的分布情況
　　96株S.epidermidis菌株ermC基因的陽性擴增率為94.8％(91/96); ermA及ermB基因的陽性擴增率均為6.2％(6/96)。統(tǒng)計學分析結果提示，各基因的分布情況在生物膜形成不同影響類型臨床分離S.epidermidis菌株之間無差異(p＞0.05)。其中ermC基因在生物膜形成發(fā)生抑制、誘導和不受

14、影響的S.epidermidis菌株中分布率分別為:100％、95.7％和94.2％。將各菌株擴增出的ermC基因產(chǎn)物進行堿基序列測定，并將測得的堿基序列在Pubmed NCBI基因庫中進行同源序列比對，結果各菌株測得的堿基序列與NCBI基因庫中的同源序列比較，同源性達99％，未發(fā)現(xiàn)有意義的突變位點。
　　2、實驗菌株ermC基因轉錄表達水平的時間-效應結果
　　對臨床分離S.epidermidis菌株SH04和SH10 e

15、rmC基因的轉錄表達水平進行時間-效應考察發(fā)現(xiàn):在0.5 h、2h和12 h時間點，生物膜抑制菌株SH04的ermC基因的轉錄表達發(fā)生明顯抑制(p＜0.05);在6h時間點，該菌株ermC基因的轉錄表達發(fā)生明顯誘導(p＜0.05);在24 h時間點，該菌株ermC基因的轉錄表達發(fā)生抑制，但與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。在0.5 h、2h和6h時間點，生物膜誘導菌株SH10的ermC基因的轉錄表達發(fā)生顯著誘導(p＜0.0

16、5);在12h和24 h時間點，該菌株ermC基因的轉錄表達均發(fā)生抑制，但孵育12h，ERY組ermC基因的轉錄表達與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05);而孵育24 h，ERY組ermC基因的轉錄表達顯著低于對照組(p＜0.05)。
　　結論：
　　1、1/4 MIC ERY對臨床分離ERY耐藥S.epidermidis菌株生物膜形成可產(chǎn)生誘導和抑制兩種相反的作用。
　　2、ERY耐藥表型與1/4 MIC E