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文檔簡介
1、中藥“十八反”是中藥配伍禁忌理論的核心內容之一。藜蘆味苦、性寒,有涌吐風痰、殺蟲療瘡的功效,曾以良好的降壓效果一度作為臨床上熱門的降壓藥被廣泛使用[1],近年來,國內外學者應用現代科學技術,對藜蘆堿毒性問題進行了大量深入的研究,取得令人矚目的成果[2-3]。毒性是中藥基本的特性之一,雖然談毒色變,但如能應用得當,可治疑難雜癥,效果奇特。藜蘆堿在抗腫瘤、抗血栓方面良好的效果已被諸多醫(yī)家所證實,且具有深入挖掘的價值和廣泛的意義。但因藜蘆安全
2、窗窄,較難把握其治療劑量和中毒劑量,因此使得藜蘆在臨床上的應用受到很大限制,藜蘆和人參作為一對相反藥對,列入“十八反”行列,然而藜蘆與人參藥對的配伍應用醫(yī)案早在古時就已有記載,并傳承至今??梢娹继J與人參的配伍在治療疑難雜癥方面必有其獨到之處,如能應用現代科學技術,通過物質基礎、量毒關系、毒效機制等多方面深入研究藜蘆與人參配伍的毒理機制,闡明其相反的生物學機制,就能趨利避害,發(fā)揮藥效。并且通過這種典型藥對的配伍研究,發(fā)現相反藥對的一些共性
3、規(guī)律,找到安全有效的最佳結合點,從而為實現開發(fā)臨床安全有效的中藥配伍藥物提供重要的依據。
本文以“十八反”中人參、藜蘆藥對配伍為研究對象,以細胞色素P450酶為切入點,以HepG2細胞作為毒性的評價模型,研究了人參藜蘆合用,在體外細胞水平上的毒性作用。HepG2細胞因含有大量的線粒體,并且有著豐富的Ⅰ相Ⅱ相代謝酶,被認為是評價外來化合物毒性的理想細胞系[4]。
首先通過單用藜蘆堿處理HepG2細胞24 h后,通過檢測
4、細胞活力、觀察細胞形態(tài)、檢測HepG2細胞線粒體膜電位的變化、氧化應激的水平、細胞凋亡的程度,以及通過實時熒光定量PCR檢測凋亡相關基因,確定了不同濃度藜蘆堿對HepG2細胞造成不同程度損傷和凋亡的的毒性模型;然后以固定濃度的藜蘆堿和人參的主要成分人參皂苷以不同比例配伍后,作用于HepG2細胞,檢測細胞活力,通過DAPI染色觀察細胞核形態(tài),檢測線粒體膜電位變化、細胞凋亡的程度、以及凋亡執(zhí)行者caspase3mRNA水平的變化,確定其在細
5、胞水平上的毒性作用。通過對HepG2細胞細胞色素P450酶活性的測定、基因水平和蛋白水平的檢測,來揭示這一相反的作用機理;本文最后通過藜蘆人參配伍后作用于人肝微粒體,并與P450酶的五中亞型所對應的探針底物共同孵育,通過LC/MS-MS檢測特異性代謝產物的含量的多少來判定對代謝酶活性的影響,進一步驗證了藜蘆人參合用對細胞色素P450酶活性的影響。
結果顯示,藜蘆堿0.1~0.6 g·L-1作用于HepG2細胞可以顯著抑制細胞活
6、性,LDH釋放量顯著升高,ROS的生成量顯著增大,線粒體膜電位顯著降低,細胞凋亡率顯著升高。實時熒光定量PCR檢測顯示,凋亡相關基因P53,Bax,細胞色素c,胱天蛋白酶9,胱天蛋白酶3mRNA表達升高。0.1g·L-1藜蘆堿與人參皂苷以不同比例配伍合用后,與單用藜蘆堿相比,細胞活力下降,線粒體膜電位顯著降低,細胞凋亡率顯著升高。實時熒光定量PCR檢測caspase3發(fā)現其mRNA的表達顯著升高。對HepG2細胞CYP450亞酶進行檢測
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