STIM1-TRPC1復合體對EPCs修復損傷血管能力的影響.pdf

1、1. 背景與目的
　　 血管內皮損傷和損傷后的不良修復是冠心病、高血壓、經皮冠狀動脈介入術(percutaneous coronary intervention，PCI)后再狹窄等血管損傷性疾病發(fā)病的共同病理生理基礎。如何盡早促進血管損傷后的再內皮化是防治這類疾病形成的關鍵策略。傳統觀點認為，內皮損傷的修復主要依靠臨近成熟內皮的遷移和增殖，但其增殖能力有限。晚近的研究證實，骨髓和外周血中內皮祖細胞(endotheliAlprog

2、enitor cells，EPCs)能歸巢至損傷血管局部，分化為內皮細胞，促進血管的良性修復。EPCs的增殖、遷移等生物學行為是其修復內皮功能的基礎，然而，目前調控EPCs 生物學行為的機制，尤其是離子通道方面，仍不清楚。
　　 鈣離子是調節(jié)細胞生理功能比如增殖、分化等的重要物質基礎。研究發(fā)現，鈣離子參與調控EPCs的增殖、歸巢及分化功能。鈣離子對細胞功能的影響通過胞膜鈣通道調控的鈣內流來實現，在EPCs 這種非興奮性細胞，由于

3、缺乏電壓依賴性鈣通道，主要以鈣庫操縱性鈣通道為主(store-operated calcium channals，SOCs), SOCs 由基質交聯分子1(stromAlinteracting molecule 1，STIM1)、Orai和瞬時受體電位通道(transientreceptor potentiAlcanonical，TRPC)家族構成。STIM1在SOCs中發(fā)揮感受器作用，STIM1感受胞內鈣庫耗竭，激活Orai和TRPC

4、通道，介導鈣庫操縱性鈣內流(store-operatedcalcium entry，SOCE)，以補充胞內鈣。
　　 晚近的研究發(fā)現，基因沉默STIM1可通過抑制血管平滑肌細胞的增殖而抑制血管損傷后新生內膜的形成。TRPC1抗體也可抑制隱靜脈平滑肌細胞增殖導致的新生內膜肥厚。而EPCs作為血管損傷修復中的一重要細胞來源，STIM1及TRPC1是否也通過影響EPCs的功能而參與血管損傷修復過程的調節(jié)，目前仍不清楚。我們的前期研究發(fā)

5、現，EPCs上有STIM1和TRPC1分子的表達。因此，我們提出假設，STIM1和TRPC1可能參與EPCs 增殖、遷移等生物理學形為的調節(jié)，從而影響其修復損傷血管的能力。
　　 2.方法
　　 2.1STIM1對EPCs 修復損傷血管能力的影響2.1.1STIM1對EPCs 增殖、遷移的作用2.1.1.1大鼠骨髓源EPCs的分離培養(yǎng)和鑒定用密度梯度離心法分離大鼠骨髓源的單個核細胞，用含20％FBS的DMEM-L 培養(yǎng)基

6、培養(yǎng)。在普通顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學特征，熒光雙染實驗鑒定對DiI-Ac-LDL-和UEA-1均染色陽性的細胞為正在分化的EPCs。用流式細胞術鑒定EPCs表面分子CD34、CD45、CD133、及VEGFR2的表達。
　　 2.1.1.2 STIM1對EPCs 增殖、遷移的作用分離培養(yǎng)5-7天的大鼠骨髓源EPCs 用于實驗。將STIM1干擾腺病毒質粒(Ad-si/rSTIM1)、人源STIM1表達質粒(Ad-hSTIM1)及對

7、應的非沉默作用的對照腺病毒(NSC)轉染細胞，轉染48小時后用于實驗。采用細胞計數法和3H-TdR 摻入法檢測EPCs的增殖情況，流式細胞儀檢測細胞周期分布情況，較正的boyden小室檢測細胞的遷移能力。
　　 2.1.2 觀察STIM1對EPCs 修復損傷血管能力的影響復制大鼠頸動脈球囊損傷模型，用2％戊巴比妥鈉麻醉后，以頸前正中線為切口，暴露左頸總動脈分叉，分離頸外動脈，分別在頸外動脈近、遠兩側套線，結扎其遠側。
　　

8、 用動脈夾暫時阻斷頸內和頸總動脈血流，在頸外動脈結扎近側穿刺，繼之將2FForgarty 導管沿小口送入頸總動脈大約1-2cm，以1.5 atm-2 atm 充盈球囊，阻斷血流約30秒，然后緩慢來回抽動球囊，反復3次，退出導管,結扎頸外動脈，常規(guī)縫合傷口。術后立即經尾靜脈注入事先轉染Ad-si/rSTIM1、Ad-hSTIM1和NSC 并且經Dil-LDL 標記的EPCs(1×106)。術后用青霉素預防感染。伊文氏藍染色觀察損傷后7天

9、、14天血管再內皮化。HE 染色觀察損傷后14天新生內膜的增生情況。
　　 2.2 觀察STIM1與TRPC1相互作用調控EPCs的鈣庫操縱性鈣內流免疫熒光檢測TRPC1在EPCs的定位，免疫共沉淀檢測STIM1與TRPC1在EPCs的相互作用。RT-PCR和Western blot 檢測TRPC1的表達，ELISA 方法檢測STIM1質粒轉染后上清中IP3蛋白的表達情況。激光共聚焦檢測EPCs內鈣變化情況。
　　 2.

10、3 TRPC1對EPCs的增殖和遷移的影響及其機制探討分離培養(yǎng)5-7天的大鼠骨髓源EPCs 用于實驗。將TRPC1的小RNA 干擾質粒(siRNA-TRPC1)及對應的非沉默作用的siRNA對照質粒(siRNA-control)、TRPC1的發(fā)夾狀RNA 干擾質粒(shRNA-TRPC1)及對應的非沉默作用的shRNA對照質粒(shRNA-control)轉染細胞，轉染48～72小時后用于實驗。采用細胞計數法和3H-TdR摻入法檢測EP

11、Cs的增殖情況，流式細胞儀檢測細胞周期，較正的boyden小室檢測細胞的遷移能力，激光共聚焦檢測EPCs內鈣變化情況。用細胞周期基因芯片篩選TRPC1干擾質粒轉染EPCs 48小時后細胞周期基因的變化情況，篩選TRPC1作用的下游靶點。
　　 選擇芯片中變化最大的基因激活和或阻斷其功能，觀察在沉默TRPC1的基礎上EPCs的增殖和細胞周期的變化，探討TRPC1的下游靶點。
　　 3．結論
　　 本研究主要結論：<