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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
體外培養(yǎng)原代大鼠卵巢顆粒細(xì)胞,觀察微囊藻毒素LR致大鼠卵巢顆粒細(xì)胞氧化損傷對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞增殖、激素分泌、DNA損傷、凋亡及凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2的影響,并探討微囊藻毒素LR致大鼠卵巢顆粒細(xì)胞氧化損傷及其作用機(jī)制。
方法:
1.無(wú)菌條件下分離提取21-25日齡雌性Wistar大鼠卵巢顆粒細(xì)胞,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,以0、10、20、30μg/mlMC-LR染毒卵巢顆粒
2、細(xì)胞,MTT法分別檢測(cè)染毒24h、48h、72h的細(xì)胞增殖情況,建立大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞MC-LR染毒模型。
2.以0、10、20、30μg/mlMC-LR染毒大鼠卵巢顆粒細(xì)胞48h,熒光法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平、比色法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中超氧化物岐化酶(T-SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。
3.染毒條件同前,MTT法檢測(cè)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖情況,電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中雌二醇(E2)和孕酮(P)
3、含量。
4.染毒條件同前,單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞DNA損傷情況。
5.染毒條件同前,TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)法檢測(cè)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況。
6.染毒條件同前,實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定大鼠卵巢顆粒細(xì)胞Bax和Bcl-2基因mRNA的表達(dá)量變化。
結(jié)果:
1.10、20、30μg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢顆粒細(xì)胞48h,細(xì)胞增殖受到明顯抑制(P﹤0.05),
4、Spearman分析提示MC-LR染毒劑量與細(xì)胞增殖呈顯著負(fù)相關(guān)(rs值=-0.767,P=0.000),有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系,因此選定48h作為MC-LR染毒大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的最優(yōu)作用時(shí)間,建立大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞MC-LR染毒模型。
2.10、20、30μg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢顆粒細(xì)胞48h,細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量隨著染毒劑量增加而增高,細(xì)胞內(nèi)ROS含量也隨著升高,同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液中T-SOD活性隨之下降;與對(duì)
5、照組比較,20μg/ml、30μg/ml染毒組細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量和細(xì)胞內(nèi)ROS含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05);與對(duì)照組比較,各劑量組細(xì)胞培養(yǎng)液中T-SOD活性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)。
3.10、20、30μg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢顆粒細(xì)胞48h,20μg/ml和30μg/ml劑量組細(xì)胞培養(yǎng)液中雌二醇(E2)、孕酮(P)含量顯著降低,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)。
6、4.10、20、30μg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢顆粒細(xì)胞48h,出現(xiàn)拖尾細(xì)胞數(shù)隨劑量增加而增加,提示細(xì)胞DNA損傷逐步加重。
5.10、20、30μg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢顆粒細(xì)胞48h,隨著染毒劑量升高卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率升高。與對(duì)照組比較,20μg/ml和30μg/ml劑量組細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
6.10、20、30μg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢顆粒細(xì)胞48h,細(xì)胞Bax基因表達(dá)上
7、調(diào), Bcl-2基因表達(dá)下調(diào),與對(duì)照組比較,20μg/ml和30μg/ml劑量組Bax、Bcl-2基因表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)。
結(jié)論:
1.體外實(shí)驗(yàn)條件下,MC-LR可引起卵巢顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,使細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高,細(xì)胞培養(yǎng)液中T-SOD活性下降,MDA含量上升,呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。
2.體外實(shí)驗(yàn)條件下,MC-LR具有卵巢顆粒細(xì)胞毒性,可明顯抑制大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的增殖,
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