微囊藻毒素LR致大鼠卵巢顆粒細(xì)胞氧化損傷及機(jī)制探討.pdf

1、目的：
　　 體外培養(yǎng)原代大鼠卵巢顆粒細(xì)胞，觀察微囊藻毒素LR致大鼠卵巢顆粒細(xì)胞氧化損傷對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞增殖、激素分泌、DNA損傷、凋亡及凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2的影響，并探討微囊藻毒素LR致大鼠卵巢顆粒細(xì)胞氧化損傷及其作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.無(wú)菌條件下分離提取21-25日齡雌性Wistar大鼠卵巢顆粒細(xì)胞，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以0、10、20、30μg/mlMC-LR染毒卵巢顆粒

2、細(xì)胞，MTT法分別檢測(cè)染毒24h、48h、72h的細(xì)胞增殖情況，建立大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞MC-LR染毒模型。
　　 2.以0、10、20、30μg/mlMC-LR染毒大鼠卵巢顆粒細(xì)胞48h，熒光法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平、比色法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中超氧化物岐化酶（T-SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。
　　 3.染毒條件同前，MTT法檢測(cè)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖情況，電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中雌二醇（E2）和孕酮（P）

3、含量。
　　 4.染毒條件同前，單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞DNA損傷情況。
　　 5.染毒條件同前，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)法檢測(cè)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況。
　　 6.染毒條件同前，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定大鼠卵巢顆粒細(xì)胞Bax和Bcl-2基因mRNA的表達(dá)量變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.10、20、30μg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢顆粒細(xì)胞48h，細(xì)胞增殖受到明顯抑制（P﹤0.05），

4、Spearman分析提示MC-LR染毒劑量與細(xì)胞增殖呈顯著負(fù)相關(guān)（rs值=-0.767，P=0.000），有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，因此選定48h作為MC-LR染毒大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的最優(yōu)作用時(shí)間，建立大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞MC-LR染毒模型。
　　 2.10、20、30μg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢顆粒細(xì)胞48h，細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量隨著染毒劑量增加而增高，細(xì)胞內(nèi)ROS含量也隨著升高，同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液中T-SOD活性隨之下降；與對(duì)

5、照組比較，20μg/ml、30μg/ml染毒組細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量和細(xì)胞內(nèi)ROS含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）；與對(duì)照組比較，各劑量組細(xì)胞培養(yǎng)液中T-SOD活性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。
　　 3.10、20、30μg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢顆粒細(xì)胞48h，20μg/ml和30μg/ml劑量組細(xì)胞培養(yǎng)液中雌二醇（E2）、孕酮（P）含量顯著降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)。
　　

6、4.10、20、30μg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢顆粒細(xì)胞48h，出現(xiàn)拖尾細(xì)胞數(shù)隨劑量增加而增加，提示細(xì)胞DNA損傷逐步加重。
　　 5.10、20、30μg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢顆粒細(xì)胞48h，隨著染毒劑量升高卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率升高。與對(duì)照組比較，20μg/ml和30μg/ml劑量組細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6.10、20、30μg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢顆粒細(xì)胞48h，細(xì)胞Bax基因表達(dá)上

7、調(diào)， Bcl-2基因表達(dá)下調(diào)，與對(duì)照組比較，20μg/ml和30μg/ml劑量組Bax、Bcl-2基因表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.體外實(shí)驗(yàn)條件下，MC-LR可引起卵巢顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，使細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，細(xì)胞培養(yǎng)液中T-SOD活性下降，MDA含量上升，呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　 2.體外實(shí)驗(yàn)條件下，MC-LR具有卵巢顆粒細(xì)胞毒性，可明顯抑制大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的增殖，