哈維氏弧菌外膜蛋白OmpK的原核和真核表達(dá).pdf

1、哈維氏弧菌(Vbrio harveyi)是海水養(yǎng)殖中常見的革蘭氏陰性致病菌，其細(xì)胞表面特有的外膜蛋白(outer membrane proteins， Omps)在維持細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、物質(zhì)交換及細(xì)菌的致病過程中起著十分重要的作用，并且部分種類如OmpK等具有良好的免疫原性。弧菌外膜蛋白OmpK是一種寬宿主的噬菌體KVP-40受體，其廣泛存在于各種弧菌之中，是弧菌細(xì)胞表面一種組成性蛋白，具有與外界廣泛接觸的機(jī)會(huì)，很有可能是弧菌的表面抗原

2、之一。
　　 根據(jù)已發(fā)表的哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)外膜蛋白OmpK的基因序列(登錄號(hào)為AY332563)設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，以哈維氏弧菌基因組DNA為模板通過PCR的方法擴(kuò)增獲得OmpK成熟肽基因片段，大小約為750bp，構(gòu)建克隆載體pMD18T-OmpK，測序結(jié)果表明，該基因與已發(fā)表的哈維弧菌外膜蛋白OmpK基因序列存在99％的同源性，初步表明成功克隆了OmpK成熟肽基因片段，且該序列在GenBank上的登錄

3、號(hào)為HQ395754。重組質(zhì)粒pMD18T-OmpK經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ兩種限制性內(nèi)切酶雙酶切后回收OmpK基因片段，并將此基因亞克隆至質(zhì)粒pET30a，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建了原核表達(dá)工程菌Ecoli/pET30a-OmpK，重組菌在IPTG的誘導(dǎo)下以包涵體的方式大量表達(dá)重組蛋白，重組蛋白分子量大小約為33kD，包涵體經(jīng)EDTA、Triton、低濃度尿素等反復(fù)洗滌后，溶解至高濃度的尿素中，最后通過透析的方

4、法使重組蛋白復(fù)性，復(fù)性的重組蛋白免疫新西蘭兔制備了兔多抗OmpK血清。
　　 以已構(gòu)建好的表達(dá)載體pET30a-OmpK為模板，根據(jù)pPIC9K分泌表達(dá)載體的特征設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，通過PCR的方法擴(kuò)增得成熟肽基因片段，然后連入pPIC9K質(zhì)粒構(gòu)建了重組表達(dá)載體pPIC9K-OmpK，重組質(zhì)粒經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒雙酶切以及測序鑒定，結(jié)果表明構(gòu)建成功。大量抽提重組質(zhì)粒pPIC9K-OmpK和親本質(zhì)粒pPIC9K，經(jīng)SacⅠ線性化后通

5、過電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中。重組轉(zhuǎn)化子GS115/pPIC9K-OmpK和GS115/pPIC9K經(jīng)遺傳霉素篩選獲得了抗4.0mg/mL G418的高拷貝子；經(jīng)MM/MD平板鑒定發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子大多為Mut+；經(jīng)菌落PCR鑒定發(fā)現(xiàn)目的基因成功整合入畢赤酵母基因組中。陽性轉(zhuǎn)化子在甲醇的誘導(dǎo)作用下分泌表達(dá)重組蛋白，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明重組蛋白分子量約為37KD且被過度糖基化。重組蛋白經(jīng)Western-Blot鑒定發(fā)現(xiàn)其

6、能與原核表達(dá)的兔多抗OmpK包涵體血清發(fā)生反應(yīng)，說明重組蛋白成功表達(dá)且其免疫原性不受影響。
　　 以表達(dá)載體pET30a-OmpK為模板，根據(jù)pPIC3.5K胞內(nèi)表達(dá)載體的特征設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，通過PCR方法擴(kuò)增得OmpK成熟肽基因片段，然后連入pPIC3.5K質(zhì)粒構(gòu)建了穿梭載體pPIC3.5K-OmpK，SalⅠ線性化重組質(zhì)粒pPIC3.5K-OmpK和親本質(zhì)粒pPIC3.5K后以氯化鋰法轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115，轉(zhuǎn)化子經(jīng)遺傳

7、霉素篩選抗2.0mg/mL G418的高拷貝子，經(jīng)MM/MD平板鑒定其表型，隨后抽提轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，以兩對(duì)引物對(duì)其進(jìn)行反復(fù)鑒定，結(jié)果表明成功構(gòu)建了酵母陽性轉(zhuǎn)化子GS115/pPIC3.5K-OmpK和GS115/pPIC3.5K，陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)甲醇的誘導(dǎo)后胞內(nèi)表達(dá)重組蛋白，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明重組蛋白分子量約為28.7KD，經(jīng)酸洗玻璃珠法發(fā)現(xiàn)重組蛋白在胞內(nèi)以包涵體的方式進(jìn)行表達(dá)，Western-Blot鑒定發(fā)現(xiàn)其能與兔多抗O