哈維氏弧菌外膜蛋白OmpK的原核和真核表達.pdf

1、哈維氏弧菌(Vbrio harveyi)是海水養(yǎng)殖中常見的革蘭氏陰性致病菌，其細胞表面特有的外膜蛋白(outer membrane proteins， Omps)在維持細菌細胞結構穩(wěn)定、物質交換及細菌的致病過程中起著十分重要的作用，并且部分種類如OmpK等具有良好的免疫原性?；【饽さ鞍譕mpK是一種寬宿主的噬菌體KVP-40受體，其廣泛存在于各種弧菌之中，是弧菌細胞表面一種組成性蛋白，具有與外界廣泛接觸的機會，很有可能是弧菌的表面抗原

2、之一。
　　 根據(jù)已發(fā)表的哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)外膜蛋白OmpK的基因序列(登錄號為AY332563)設計1對特異性引物，以哈維氏弧菌基因組DNA為模板通過PCR的方法擴增獲得OmpK成熟肽基因片段，大小約為750bp，構建克隆載體pMD18T-OmpK，測序結果表明，該基因與已發(fā)表的哈維弧菌外膜蛋白OmpK基因序列存在99％的同源性，初步表明成功克隆了OmpK成熟肽基因片段，且該序列在GenBank上的登錄

3、號為HQ395754。重組質粒pMD18T-OmpK經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ兩種限制性內切酶雙酶切后回收OmpK基因片段，并將此基因亞克隆至質粒pET30a，轉入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，構建了原核表達工程菌Ecoli/pET30a-OmpK，重組菌在IPTG的誘導下以包涵體的方式大量表達重組蛋白，重組蛋白分子量大小約為33kD，包涵體經(jīng)EDTA、Triton、低濃度尿素等反復洗滌后，溶解至高濃度的尿素中，最后通過透析的方

4、法使重組蛋白復性，復性的重組蛋白免疫新西蘭兔制備了兔多抗OmpK血清。
　　 以已構建好的表達載體pET30a-OmpK為模板，根據(jù)pPIC9K分泌表達載體的特征設計一對特異性引物，通過PCR的方法擴增得成熟肽基因片段，然后連入pPIC9K質粒構建了重組表達載體pPIC9K-OmpK，重組質粒經(jīng)菌落PCR、質粒雙酶切以及測序鑒定，結果表明構建成功。大量抽提重組質粒pPIC9K-OmpK和親本質粒pPIC9K，經(jīng)SacⅠ線性化后通

5、過電轉的方法轉入畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞中。重組轉化子GS115/pPIC9K-OmpK和GS115/pPIC9K經(jīng)遺傳霉素篩選獲得了抗4.0mg/mL G418的高拷貝子；經(jīng)MM/MD平板鑒定發(fā)現(xiàn)轉化子大多為Mut+；經(jīng)菌落PCR鑒定發(fā)現(xiàn)目的基因成功整合入畢赤酵母基因組中。陽性轉化子在甲醇的誘導作用下分泌表達重組蛋白，SDS-PAGE電泳結果表明重組蛋白分子量約為37KD且被過度糖基化。重組蛋白經(jīng)Western-Blot鑒定發(fā)現(xiàn)其

6、能與原核表達的兔多抗OmpK包涵體血清發(fā)生反應，說明重組蛋白成功表達且其免疫原性不受影響。
　　 以表達載體pET30a-OmpK為模板，根據(jù)pPIC3.5K胞內表達載體的特征設計一對特異性引物，通過PCR方法擴增得OmpK成熟肽基因片段，然后連入pPIC3.5K質粒構建了穿梭載體pPIC3.5K-OmpK，SalⅠ線性化重組質粒pPIC3.5K-OmpK和親本質粒pPIC3.5K后以氯化鋰法轉入畢赤酵母GS115，轉化子經(jīng)遺傳

7、霉素篩選抗2.0mg/mL G418的高拷貝子，經(jīng)MM/MD平板鑒定其表型，隨后抽提轉化子的基因組DNA，以兩對引物對其進行反復鑒定，結果表明成功構建了酵母陽性轉化子GS115/pPIC3.5K-OmpK和GS115/pPIC3.5K，陽性轉化子經(jīng)甲醇的誘導后胞內表達重組蛋白，SDS-PAGE電泳結果表明重組蛋白分子量約為28.7KD，經(jīng)酸洗玻璃珠法發(fā)現(xiàn)重組蛋白在胞內以包涵體的方式進行表達，Western-Blot鑒定發(fā)現(xiàn)其能與兔多抗O