利用高分辨熔解曲線分析技術快速檢測鑒定四種臨床常見侵襲性曲霉菌的方法學研究.pdf

1、侵襲性真菌感染是免疫力低下病人不得不面臨的嚴峻挑戰(zhàn)。近些年，腫瘤，艾滋病，器官移植等免疫低下病人的侵襲性真菌感染率不斷上升，且死亡率極高。臨床上侵襲性真菌感染的常見病原多為念珠菌屬，但隱球菌尤其是新生隱球菌，絲狀真菌尤其是曲霉菌屬等條件致病性真菌感染的發(fā)生近年來也呈逐年上升趨勢。對于這些感染的臨床治療而言，治療效果很大程度上取決于病人的免疫力狀況及能否及時給與準確有效的抗真菌藥物。目前臨床上常用的抗真菌藥物主要有兩性霉素B，酮康唑，氟康

2、唑，泊沙康唑、卡泊芬凈等。有文獻報道，臨床上分離到越來越多的對唑類抗真菌藥物和兩性霉素B耐藥的曲霉菌株，因此有必要研究一種能夠快速檢測鑒定臨床常見曲霉菌的方法，為臨床進行更有效的侵襲性曲霉菌感染治療提供參考。
　　 高分辨熔解曲線分析技術的基本原理是在PCR完成后，升高PCR體系溫度，利用雙鏈DNA飽和熒光染料，實時監(jiān)測升溫過程中雙鏈DNA飽和熒光染料與體系中DNA雙鏈的結合情況（儀器上反映為熒光信號的變化），達到DNA雙鏈序列

3、分析的目的。雙鏈DNA飽和熒光染料的結合原理與傳統(tǒng)的熒光定量PCR染料不同。傳統(tǒng)的熒光染料如SybrGreen等屬于不飽和熒光染料，體系中此種熒光染料存在對PCR反應有抑制作用，因此在體系中加入的不飽和熒光染料濃度很低，遠遠低于產物DNA雙鏈結構中染料結合位點的數目，DNA雙鏈結構中存在大量的空余熒光染料結合位點。PCR過程完成產生大量的產物DNA雙鏈，熒光染料分子結合在產物DNA雙鏈上的染料結合位點。隨著體系溫度逐漸升高，體系中的DN

4、A雙鏈開始變性解鏈，熒光染料分子逐漸離開DNA雙鏈結合位點，反映為熒光信號的逐漸降低。SybrGreen等不飽和熒光染料分子在離開DNA雙鏈的過程中會發(fā)生分子結合位置的重排，因DNA解鏈而離開的不飽和熒光染料分子會迅速重新結合到尚未解鏈的其他雙鏈部分上空余染料結合位點，熒光信號的變化失真，不能準確反映體系內DNA雙鏈的解鏈情況。而飽和熒光染料如LCGreen等對PCR反應基本無抑制作用，PCR體系中熒光染料的添加量遠遠高于體系中DNA雙

5、鏈上的染料結合位點數目，DNA雙鏈上不會存在空余的染料結合位點，解鏈過程中能夠最大程度上減少染料分子重排。體系溫度升高，體系中DNA雙鏈變性解鏈，飽和熒光染料分子與解鏈的DNA雙鏈解離，因其他尚未解鏈的DNA雙鏈上不存在空余結合位點，解離的染料分子不會重新結合到雙鏈DNA上，熒光信號的變化能夠真實反映體系中雙鏈DNA的解鏈情況，使利用熔解曲線進行序列分析成為可能。
　　 不對稱PCR擴增技術(asymmetricPCR)顧名思義

6、，不對稱PCR方法中兩種引物的量相差懸殊，通常1:5～1:100不等，其中量相對較少的引物稱為限制引物，相對過量的引物稱為過剩引物。不對稱PCR體系在反應的前幾十個循環(huán)中同時存在正向引物和反向引物，可以生成一定數量的雙鏈產物，經過15-30個循環(huán)左右，濃度相對較低的限制引物消耗完全。在PCR反應的后面幾十個循環(huán)中，體系中僅存在過剩引物。過剩引物在體系中擴增產生大量的單鏈DNA。
　　 在高分辨熔解曲線的基本分析原理和不對稱PCR

7、擴增技術的基礎上，引入非標記探針技術，是對高分辨熔解曲線技術的一種延伸和應用。非標記探針是長度在20-40bp左右的3'端封閉阻止延伸的一段寡核苷酸鏈。與傳統(tǒng)的熒光探針相比，非標記探針寡核苷酸鏈只需要在探針的3'端進行封閉阻止其在PCR過程中發(fā)生自身擴增，而無需任何熒光基團修飾。在PCR反應完成后，進行一個變性，復性的基本過程，探針結合到單鏈產物上，形成局部雙鏈結構。再進行升溫變性，采集熒光信號，在相對較低的溫度時，探針與產物結合形成的

8、局部雙鏈結構發(fā)生解鏈，反映為熒光信號降低，產生探針熔解峰。繼續(xù)升溫，PCR體系中產生的目的DNA產物發(fā)生熔解解鏈，熒光信號降低明顯，產生產物熔解峰。通過分析探針峰和產物熔解峰的熔解溫度(meltingtemperature，Tm)，使序列分析更加敏感，特異。
　　 在本研究中，我們將高分辨熔解曲線分析技術，非標記探針技術和不對稱PCR技術引入四種臨床常見曲霉菌的檢測鑒定中，試圖探索一種快速，準確，經濟的曲霉菌病原檢測鑒定方法。<

9、br>　　 第一部分，“高分辨熔解曲線分析通用真菌引物擴增片段檢測鑒定四種常見曲霉菌”
　　 研究方法：
　　 查找GeneBank中公布的隱球菌屬，念珠菌屬，曲霉菌屬，青霉屬等多種臨床常見真菌及人類的18SrRNA、5.8SrRNA、28SrRNA以及ITS1、2基因序列。通過ClustalX軟件比對找出與人類無序列同源性的真菌保守區(qū)段。以真菌核糖體RNA基因中的內轉錄間隔區(qū)2(ITS2)為靶基因，在5.8S和28S

10、核糖體RNA基因上設計真菌通用引物，在BLAST中比對其特異性。利用設計的真菌通用引物擴增四種曲霉菌的ITS2段，將擴增產物進行高分辨熔解曲線分析。
　　 選擇煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉ATCC標準菌株、臨床常見多種細菌和人DNA進行引物特異性檢測。
　　 選擇對熒光定量PCR和高分辨熔解曲線分析有較大影響的因素，如退火溫度，引物濃度，Mg2+濃度等進行體系的優(yōu)化。
　　 以煙曲霉ITS2PCR合成產物構建載

11、體克隆進行靈敏度檢測。將構建成功的質粒，按照1:10倍比稀釋，稀釋9個濃度梯度，在各濃度取1u(l)進行熒光定量PCR擴增。
　　 實驗結果：
　　 1、設計的引物序列PrimerF-AGCGAAATGCGATAASTARTGTG,PrimerRTCCTCCGCTTATTGATATGC，擴增片段長度335bp。
　　 2、引物特異性檢測結果可見只有相應的四種曲霉菌有擴增條帶，細菌及人DNA均未擴增。
　　

12、 3、該方法的檢測限可達10copies/ul.
　　 4、高分辨熔解曲線分析結果顯示，煙曲霉，黃曲霉，土曲霉，黑曲霉四種曲霉菌的熔解曲線形狀和Tm值差異較大。
　　 結論：
　　 此部分的研究證實，四種曲霉菌的ITS2段靶基因熔解曲線差異大，通過這種方法不需測序可以將四種曲霉菌鑒別出來。
　　 若將此方法擴展至其他臨床病原真菌，建立臨床病原真菌的熔解曲線標準庫。只需要基本的PCR引物，待測菌株DNA模板

13、，LCGreen飽和熒光染料，和能夠進行高分辨熔解曲線分析的儀器，在熔解曲線分析完成后，將待測菌株擴增產物的熔解曲線與熔解曲線標準庫中的曲線進行比對，在一定程度上能夠將熔解曲線標準庫中已存在熔解曲線比對標準的臨床病原真菌待測菌株快速檢測鑒定出來，具有省時、省力、省錢的特點。
　　 第二部分，“四種特異性非標記探針結合高分辨熔解曲線檢測鑒定四種常見曲霉菌”
　　 研究方法：
　　 根據核糖體RNA基因的內轉錄間隔區(qū)

14、2可變區(qū)序列設計四種曲霉菌的種特異性探針，并將探針的3'端進行C6氨基化修飾封閉以阻止在體系中DNA聚合酶的作用下探針自身擴增延伸。在Oligo6.0和PrimerExpress3.0軟件中評價引物與探針，在BLAST中比對探針與引物的特異性。
　　 利用第一部分中設計的通用真菌引物進行不對稱PCR。PCR完成后，加入四種曲霉菌特異性非標記探針，再經過變性復性，使探針與產物單鏈形成局部雙鏈結構，進行熔解曲線分析.
　　

15、選擇對不對稱PCR體系有較大影響的退火溫度，引物濃度，引物比例，Mg2+濃度，探針濃度等因素優(yōu)化體系。退火溫度由50℃遞增至65℃，引物濃度由0.1μmol/L逐漸遞增至0.5μmol/L，上下游引物比例由1:2遞增至1:20及2:1遞增至20:1，探針濃度由0.05μmol/L遞增至0.5μmol/L，Mg2+濃度由0.5mmol/L遞增至5mmol/L進行體系優(yōu)化。
　　 實驗結果：
　　 1、優(yōu)化后最終的體系組成和

16、反應條件為:5×PrimeSTARBuffer，4μl;Mg2+，1mmol/L，dNTPMixture(各2.5mmol/L)，1.6μl;引物F，0.25μmol/L;引物R，0.05μmol/L;PrimeSTARHSDNAPolymerase,0.2μl;LCGreen染料，1μl;四種探針各0.25μmol/L。模板，1μl;及去離子水，體系總體積20μl。PCR條件:98℃，10s;60℃，10s;72℃，18s;循環(huán)數60

17、，PCR擴增完成后進行一個變性復性的過程以促進探針與產物單鏈的結合。98℃，60s，40℃，30s。經過變性復性過程使3'端封閉的探針與產物單鏈結合后，設置熔解起始溫度為55℃，結束溫度為98℃，保持溫度為53℃。
　　 2、四種曲霉菌模板相應的非標記探針熔解曲線分析都出現了兩座熔解峰。根據第一部分中四種曲霉菌真菌通用引物擴增片段高分辨熔解曲線分析結果可知，ITS2擴增產物片段的Tm值介于90°C-95°C之間，故Tm值介于90

18、°C-95°C之間的熔解峰使不對稱PCR擴增的前幾十個循環(huán)產生的雙鏈產物的熔解峰，即產物峰。根據軟件評估可知，探針的Tm值高于75°C。故圖中Tm值介于82°C-87°C之間的熔解峰為非標記探針與不對稱PCR擴增的后幾十個循環(huán)，濃度相對較低的下游引物耗盡時，由濃度相對較高的上游引物擴增得到的單鏈產物結合形成的局部雙鏈結構的熔解峰，即探針熔解峰。探針峰與產物峰之間的Tm值差異明顯。
　　 討論：
　　 由于核糖體RNA基因

19、的內轉錄間隔區(qū)2同時包含著可變區(qū)和中度保守區(qū)序列。根據GeneBank中已公布的煙曲霉，黃曲霉，土曲霉，黑曲霉菌核糖體RNA基因的內轉錄間隔區(qū)2序列發(fā)現，內轉錄間隔區(qū)2的可變區(qū)中不僅存在著種間差異，也存在著種內序列差異，長度由1-3bp不等。飽和熒光染料高分辨熔解曲線可檢測出低至1bp的堿基差異。由于種內序列差異的存在，使得高分辨熔解曲線的形狀和Tm值可能發(fā)生變形和移動，給鑒定帶來一定的困難。
　　 我們根據四種曲霉菌的核糖體R

20、NA基因的可變區(qū)ITS2區(qū)序列，設計了具有曲霉菌種特異性的探針，并將探針的3'端進行C6氨基修飾阻止探針與模板結合后發(fā)生延伸。加入不同濃度的上下游引物，進行不對稱PCR。不對稱PCR完成后，體系中存在兩種PCR產物，一種是在PCR過程的前幾十個循環(huán)產生的正常的雙鏈目的產物，一種則是在濃度相對較低的引物消耗完全后，由濃度相對較高的引物在PCR過程的后幾十個循環(huán)產生的大量單鏈產物。經過變性復性過程，探針與PCR過程的后幾十個循環(huán)產生的大量產

21、物單鏈結合形成局部雙鏈結構，探針-產物單鏈形成的雙鏈結構經過升溫變性產生探針峰，而由PCR過程的前幾十個循環(huán)產生的雙鏈產物在升溫變性過程中產生產物峰，通過分析探針峰和產物峰的峰形和Tm值，達到檢測鑒定四種曲霉菌的目的。利用曲霉菌的種特異性探針，分析探針與單鏈產物形成的雙鏈結構熔解產生的探針峰，使我們不需要建立曲霉菌熔解曲線標準庫就可以鑒定出曲霉菌的種屬。更重要的是，引入非標記探針，能夠克服曲霉菌的核糖體RNA基因的內轉錄間隔區(qū)2可變區(qū)種