金納米顆粒標記呼吸道合胞病毒入侵細胞的實時暗場光散射成像分析.pdf

1、病毒，尤其是傳染性病毒，對人類身體健康具有很大危害。因此，了解和闡明病毒入侵宿主細胞的過程和機制對預防和治療病毒性疾病十分重要。目前，研究病毒入侵細胞過程常采用單個病毒視蹤技術，即通過觀察單個病毒入侵宿主細胞的實時動態(tài)過程來闡釋病毒入侵宿主細胞的機制。近年來，為成功示蹤病毒，人們常利用熒光蛋白分子或熒光染料對病毒和細胞進行熒光標記，但存在著熒光強度低、易光漂白等缺點，難于長時間示蹤單個病毒。熒光量子點可以避免上述缺點，但其生物相容性和穩(wěn)

2、定性有待提高。因此如何避免標記材料自身的不足是一個值得研究的問題。本文利用生物相容性好的金納米顆粒標記呼吸道合胞病毒(RSV)，實現(xiàn)對單個病毒侵染宿主細胞過程的長時間實時成像，有利于進一步了解呼吸道合胞病毒侵染機制。具體的研究內(nèi)容包括以下三個方面:
　　1.選擇性定量細胞膜表面吸附的呼吸道合胞病毒。利用RSV多克隆抗體修飾的金納米顆粒靶向標記病毒，并以宿主細胞作為檢測病毒的基底，通過統(tǒng)計靶向于細胞膜表面病毒所在位置的金納米顆粒的散

3、射信號的百分比，實現(xiàn)可視化定量細胞膜表面的病毒。當將一定量的病毒加入細胞基底并洗棄未侵染細胞的多余病毒后，再加入RSV多克隆抗體修飾的金納米顆粒反應一段時間，讓金納米顆粒靶向結(jié)合到細胞表面的病毒，在暗場下成像觀察發(fā)現(xiàn)，隨著所加病毒量增加，細胞表面金納米顆粒的散射信號逐漸增強。將所得成像數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)病毒的量和細胞膜表面金納米顆粒散射信號的百分比呈函數(shù)增長。此實驗以細胞作為病毒檢測基底，金納米顆粒散射信號作為檢測病毒量的信號，實現(xiàn)了可視

4、化定量具有感染能力的病毒。由此，對具有侵染能力的病毒建立了一種選擇性強，靈敏度高，操作簡單的可視化分析方法。
　　2.金納米顆粒標記病毒侵染細胞的過程實時監(jiān)控。利用鏈霉親和素(SA)修飾的金納米顆粒對病毒進行標記，在暗場下通過觀察金納米顆粒修飾的病毒的散射信號，實現(xiàn)長時間實時觀察病毒侵染細胞的過程。SA是一種含有巰基的蛋白，可以通過金硫鍵修飾到金納米顆粒表面。另外通過對病毒表面的膜蛋白進行生物素(Biotin)標記制得生物素標記病

5、毒。由于一分子SA可以和四分子生物素高度特異性結(jié)合，故SA修飾的金納米顆粒能用于標記生物素化的病毒。金納米顆粒具有獨特的局域表面等離子體共振(LSPR)性質(zhì)，因此通過在暗場顯微鏡下觀察金納米顆粒修飾病毒的散射信號就可長時間實時觀察病毒入侵細胞的過程。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，病毒入侵細胞的過程快速、短暫，大約1分鐘左右的時間，且病毒入侵細胞可能是一個胞吞的過程。與其他熒光信號標記病毒方法相比，金納米顆粒生物相容性好，穩(wěn)定性好，不存在信號強度低和易光

6、漂白的問題，并且這種標記策略簡單、溫和、對病毒感染力影響較小。
　　3.熒光和散射雙模式成像呼吸道合胞病毒的核酸。本實驗將金納米顆粒作為能量供受體和發(fā)光元件，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA作為病毒核酸RNA分子檢測元件，實現(xiàn)了病毒侵入細胞后，病毒核酸RNA復制過程的熒光和暗場雙模式成像。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA通過5'端的巰基偶聯(lián)至金納米顆粒表面，導致其3'端四甲基羅丹明（TAMRA）的熒光淬滅，金納米顆粒的散射信號減弱呈暗綠色。在堿基互補配對作用下，

7、發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖部閉合。當發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA的環(huán)部與病毒核酸RNA雜交，金納米顆粒上的發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，TAMRA熒光恢復，金納米顆粒散射信號增強呈亮綠色。從而實現(xiàn)了對細胞內(nèi)病毒核酸RNA熒光和暗場雙模式成像。進一步研究發(fā)現(xiàn)，病毒侵入細胞后，在細胞膜附近區(qū)域進行大量核酸復制。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA修飾的金納米顆粒探針制備簡單，且將熒光成像和暗場成像成功的結(jié)合，可能被廣泛應用于生物醫(yī)學成像領域。
　　綜上所述，本文利用金納米顆粒實現(xiàn)了對RSV簡單快速

8、標記，利用金納米顆粒的散射信號，借助于暗場光散射成像技術，成功實現(xiàn)長時間示蹤病毒侵染細胞過程。本文在保證病毒自身感染力的情況下實現(xiàn)了對病毒的簡單快速標記。選用金納米顆粒作為標記材料避免了熒光染料和熒光蛋白的熒光信號弱、易光漂白及量子點生物相容性低、穩(wěn)定性不好等缺點。本文也實現(xiàn)了對細胞膜表面病毒的定量檢測、病毒入侵細胞過程及病毒在細胞內(nèi)復制RNA核酸過程的成像。論文對病毒侵染細胞過程由外到內(nèi)一一進行成像分析，這對深入了解病毒侵染細胞機制提