EphrinB2-ephB2調(diào)節(jié)ENS突觸可塑性參與IBS內(nèi)臟高敏感的機(jī)制研究.pdf

1、目的：內(nèi)臟高敏感是腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）最重要的生物標(biāo)志，與反復(fù)發(fā)作的腹痛有關(guān)，其具體的分子機(jī)制尚未完全明確。前期研究發(fā)現(xiàn)，感染后IBS模型鼠腸系膜傳入神經(jīng)自發(fā)性放電活動(dòng)增強(qiáng)，且對(duì)機(jī)械和化學(xué)刺激更為敏感，表明腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS）處于高敏狀態(tài)，而ENS高敏狀態(tài)是持續(xù)內(nèi)臟高敏感的關(guān)鍵。中樞海馬神經(jīng)元突觸可塑性是中樞記憶形成的標(biāo)志，與疼痛的中樞致敏

2、有關(guān)，是否ENS也有類似形成“記憶”的基礎(chǔ)導(dǎo)致EN S持續(xù)高敏呢？EphrinB2/EphB2受體酪氨酸激酶分布于突觸前后膜，尤其在興奮性突觸中表達(dá)，對(duì)突觸形成和功能維持有重要作用，參與中樞突觸可塑性調(diào)控。有“腸腦”之稱的ENS與中樞存在共性，其突觸可塑性的調(diào)控是否可能存在相同的通路呢？因此，推測(cè)EphrinB2/EphB2可能參與調(diào)控ENS突觸可塑性，使ENS處于高敏狀態(tài)，產(chǎn)生外周“記憶”，進(jìn)而參與內(nèi)臟高敏感的形成。
　　方法：

3、（1）收集正常人及IBS-D、IBS-C患者結(jié)腸活檢黏膜組織，通過(guò)免疫熒光和免疫印跡檢測(cè)ephrinB2/ephB2在人結(jié)腸ENS中的分布和表達(dá)，突觸可塑性相關(guān)即刻早期基因c-fos和arc表達(dá)，突觸相關(guān)蛋白PSD95和Synaptophysin表達(dá)，興奮性谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體VG luT及受體N M DA R表達(dá)，及其與腹痛的相關(guān)性。
　?。?）采用旋毛蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的PI-IBS內(nèi)臟高敏感模型，分為正常組（NC）、PI-IBS組（VH）和

4、PI-IBS干預(yù)組（VH+EphB2Fc）。模型評(píng)價(jià)采用HE染色炎癥評(píng)分評(píng)估腸道炎癥水平，AWR評(píng)分及腸系膜傳入神經(jīng)放電記錄評(píng)估內(nèi)臟高敏感狀態(tài)。通過(guò)免疫熒光和免疫印跡/RT-PCR檢測(cè)ephrinB2/ephB2在ENS中的分布和表達(dá)及其與內(nèi)臟高敏感的相關(guān)性，突觸可塑性相關(guān)即刻早期基因c-fos、arc、bd nf、pt gs2、cr eb、crème和icer表達(dá)。通過(guò)透射電鏡檢測(cè)ENS突觸囊泡密度，免疫熒光檢測(cè)ENS突觸密度，免疫印

5、跡檢測(cè)突觸前后相關(guān)蛋白PSD95和Synap top hys in、S ynap tobre vin表達(dá)，評(píng)估突觸結(jié)構(gòu)可塑性。通過(guò)免疫熒光和免疫印跡/RT-PCR檢測(cè)興奮性谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體VGluT及受體N MDA R表達(dá)和磷酸化，評(píng)估突觸功能可塑性。
　?。?）通過(guò)體外LMMP組織培養(yǎng)，并給與EphrinB2-Fc（eB2Fc）活化ephB2信號(hào)通路，并分別加入Erk/MAPK通路抑制劑PD98059和U0126、PI3K/Akt通

6、路抑制劑LY294002和PLCγ抑制劑U73122、PKC抑制劑Chelerytrine、CaMKⅡ抑制劑KN93，觀察ENS突觸結(jié)構(gòu)可塑性改變。通過(guò)原代ENS神經(jīng)元培養(yǎng)，觀察eB2Fc對(duì)ENS神經(jīng)元纖維新生（初級(jí)神經(jīng)突、次級(jí)神經(jīng)突和神經(jīng)突分支節(jié)點(diǎn)數(shù)）、神經(jīng)元分化成熟和突觸萌芽改變。
　　（4）通過(guò)體外LMMP組織培養(yǎng)，并給與EphrinB2-Fc（eB2Fc）活化ephB2信號(hào)通路，并分別加入Src激酶抑制劑PP2、非特異性N

7、R抑制劑MK801及選擇性NR2B阻斷劑ifenprodil，觀察ENS突觸功能可塑性改變。通過(guò)原代ENS神經(jīng)元培養(yǎng)，觀察eB2Fc對(duì)ENS突觸可塑性因子c-fos及谷氨酸誘導(dǎo)的[Ca2+]i的影響。
　　結(jié)果：（1）EphrinB2/ephB2相對(duì)特異性表達(dá)于人體結(jié)腸黏膜ENS，而且在IBS-D、IBS-C患者中呈高表達(dá)水平。IBS患者結(jié)腸黏膜EN S存在明顯突觸前后可塑性改變。EphrinB2/ephB2表達(dá)與IBS患者腹痛癥

8、狀程度呈明顯正相關(guān)，且與c-fos水平呈顯著正相關(guān)。
　　（2）Ep hr in B2/ep h B2表達(dá)于大鼠結(jié)腸肌間、黏膜下神經(jīng)叢及其神經(jīng)纖維。VH鼠AWR評(píng)分增加、疼痛閾值降低，腸系膜傳入神經(jīng)自發(fā)放電顯著增加且對(duì)刺激的敏感性增加；EphrinB2表達(dá)、ephB2磷酸化水平顯著增加，與疼痛呈相關(guān)性負(fù)相關(guān)。突觸可塑性相關(guān)即刻早期基因c-fos、arc表達(dá)增加。VH鼠存在明顯突觸結(jié)構(gòu)可塑性，ENS突觸密度增加，突觸囊泡密度增加，突

9、觸蛋白PSD95和Synap top hys in、S ynaptob re vin表達(dá)增加。VH鼠存在明顯突觸功能可塑性，NR1、NR2B表達(dá)及N R2B磷酸化（Y1472）增加，VGluT1、VGluT2表達(dá)增加。EphB2Fc明顯阻斷VH鼠ENS突觸結(jié)構(gòu)和功能可塑性，并改善PI-IBS鼠內(nèi)臟敏感性。
　?。?）EphrinB2Fc促進(jìn)LMMP組織ENS突觸結(jié)構(gòu)可塑性改變，并且可被PI3K/Akt抑制劑LY294002顯著阻斷

10、，被Erk/M APK通路抑制劑PD98059和U0126部分阻斷，PLCγ/PKC、CaMKⅡ阻斷無(wú)明顯作用。EphrinB2Fc促進(jìn)ENS神經(jīng)元纖維新生（初級(jí)神經(jīng)突、次級(jí)神經(jīng)突和神經(jīng)突分支節(jié)點(diǎn)數(shù)增加）、神經(jīng)元分化成熟（神經(jīng)突生長(zhǎng)的神經(jīng)元比例增加）和突觸萌芽增加。
　?。?）EphrinB2Fc促進(jìn)LMMP組織ENS突觸功能可塑性改變，增加NR2B（Y1472）磷酸化水平，及CREB（S133）磷酸化和c-fos、arc表達(dá)水平

11、，并且可被PP2顯著抑制。MK801、ifenprodil顯著抑制CREB（S133）磷酸化和c-fos、arc表達(dá)水平。EphrinB2Fc促進(jìn)ENS活化c-fos mRN A表達(dá)，增加谷氨酸誘導(dǎo)的[Ca2+]i。
　　結(jié)論：Ephr inB2/ep hB2表達(dá)于腸神經(jīng)元，且與IBS患者腹痛癥狀程度及IBS模型內(nèi)臟高敏感明顯相關(guān)，在ENS突觸可塑性調(diào)控具有關(guān)鍵作用。EphrinB2/ephB2通過(guò)活化下游PI3K/Akt、Erk