間歇性低氧對(duì)大鼠腦缺血后空間記憶及海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響.pdf

1、目的：探討間歇性低氧對(duì)大鼠腦缺血后空間記憶及海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)將健康雄性 Wistar大鼠120只采用數(shù)字隨機(jī)法分成正常對(duì)照組（n=20）（UC組）、單純腦缺血組（n=20）（IR組）、間歇性低氧7天腦缺血組（IH7+IR組）（n=20）、間歇性低氧14天腦缺血組（IH14+IR組）（n=20）、間歇性低氧21天腦缺血組（IH21+IR組）（n=20）、間歇性低氧21天腦缺血+mTOR抑制劑組（抑制劑組）

2、（n=20）。間歇性低氧動(dòng)物進(jìn)入低氧艙，低氧箱內(nèi)氧氣濃度維持在5％~21%，形成周期循環(huán)，在低氧艙內(nèi)的暴露時(shí)間為7小時(shí)/天，分別持續(xù)7天、14天、21天。分別在低氧7天、14天、21天后將間歇性低氧動(dòng)物制備腦缺血再灌注模型。采用改良的Pulsinelli四血管阻斷法制備腦缺血再灌注模型，分別于缺血15min再灌注后6h、24h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠。缺血再灌注后24h采用水迷宮法檢測(cè)各組大鼠視空間記憶能力。各組大鼠的標(biāo)本采用蘇木素-伊紅染色

3、法（HE）檢測(cè)大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的改變；采用免疫組織化學(xué)法和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)大鼠腦組織海馬區(qū) PI3K、mTOR、Beclin-1蛋白表達(dá)情況。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)設(shè)計(jì)的單因素方差分析，以P<0.05，表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：1、水迷宮檢測(cè)結(jié)果：與 UC組比較，IR組大鼠水迷宮檢測(cè)的逃避潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)、穿臺(tái)次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與 IR組比較，各組間

4、歇性低氧+腦缺血大鼠的逃避潛伏期時(shí)間均延長(zhǎng)、穿臺(tái)次數(shù)均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與 IH7+IR組比較，IH14+IR組、IH21+IR組大鼠的逃避潛伏期時(shí)間均延長(zhǎng)、穿臺(tái)次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與 IH14+IR組比較，IH21+IR組大鼠的逃避潛伏期時(shí)間均延長(zhǎng)、穿臺(tái)次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與 IH21+IR組比較，抑制劑組大鼠的逃避潛伏期時(shí)間減少、穿臺(tái)次數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

5、<0.05）。2、細(xì)胞形態(tài)改變結(jié)果（HE染色）：UC組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)正常，胞漿淡染，核仁明顯；與 UC組比較，IR組大鼠6h海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)即出現(xiàn)改變，表現(xiàn)為細(xì)胞失去正常結(jié)構(gòu)，部分細(xì)胞形態(tài)異常；24h海馬區(qū)可見(jiàn)腫脹的神經(jīng)元，間質(zhì)水腫，結(jié)構(gòu)疏松，神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、深染，也有部分神經(jīng)元胞核完全消失，形成空泡狀結(jié)構(gòu)；各組間歇性低氧+腦缺血大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞破壞嚴(yán)重，均可見(jiàn)較多變性壞死的神經(jīng)細(xì)胞，海馬區(qū)可見(jiàn)腫脹

6、的神經(jīng)元，間質(zhì)水腫，結(jié)構(gòu)疏松，神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、深染，也有部分神經(jīng)元胞核完全消失，形成空泡狀結(jié)構(gòu)。與 IR組比較，各組間歇性低氧+腦缺血組大鼠神經(jīng)元存活率均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與IH7+IR組比較，IH14+IR組、IH21+IR組大鼠神經(jīng)元存活率均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與 IH14+IR組比較，IH21+IR組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元存活率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與 IH21+I

7、R組比較，抑制劑組大鼠神經(jīng)元存活率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3、PI3K免疫組化和RT-PCR分析結(jié)果：免疫組化結(jié)果：PI3K免疫組化染色呈棕黃色，定位于細(xì)胞胞漿中，主要表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞中；UC組偶見(jiàn)免疫陽(yáng)性細(xì)胞，淡染，神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)正常，核仁明顯；與 UC組比較，IR組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)（6h、24h）染色增強(qiáng)，免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與 IR組比較，各組間歇性低氧+腦缺血組大鼠在各時(shí)

8、間點(diǎn)（6h、24h）染色增強(qiáng)，免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與IH7+IR組比較，IH14+IR組、IH21+IR組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)（6h、24h）染色增強(qiáng)，免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與 IH14+IR組比較，IH21+IR組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)（6h、24h）染色減弱，免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與 IH21+IR組比較，抑制劑組大鼠染色增強(qiáng)，免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，

9、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RT-PCR分析結(jié)果：與 UC組比較，IR組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)（6h、24h）PI3K蛋白的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與 IR組比較，各組間歇性低氧+腦缺血組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)（6h、24h）PI3K蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與 IH7+IR組比較，IH14+IR組、IH21+IR組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)（6h、24h）PI3K蛋白的表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

10、5)；與 IH14+IR組比較，IH21+IR組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)（6h、24h）PI3K蛋白的表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與 IH21+IR組比較，抑制劑組大鼠PI3K蛋白的表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4、mTOR免疫組化和RT-PCR分析結(jié)果：免疫組化結(jié)果：mTOR免疫組化染色呈棕黃色，定位于細(xì)胞胞漿中，主要表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞中；UC組偶見(jiàn)免疫陽(yáng)性細(xì)胞，淡染，神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)正常，核仁明顯；與 UC組

11、比較，IR組大鼠6h、24h染色均增強(qiáng)，免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與 IR組比較，各組間歇性低氧+腦缺血組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)（6h、24h）染色增強(qiáng)，免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與 IH7+IR組比較，IH14+IR組、IH21+IR組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)（6h、24h）染色增強(qiáng)，免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與 IH14+IR組比較，IH21+IR組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)

12、（6h、24h）染色增強(qiáng)，免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與 IH21+IR組比較，抑制劑組大鼠染色減弱，免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RT-PCR分析結(jié)果：與UC組比較，IR組大鼠在在各時(shí)間點(diǎn)（6h、24h）mTOR蛋白的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與 IR組比較，各組間歇性低氧+腦缺血組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)（6h、24h） mTOR蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0

13、.05)；與 IH7+IR組比較，IH14+IR組、IH21+IR組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)（6h、24h）mTOR蛋白的表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與 IH14+IR組比較，IH21+IR組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)（6h、24h）mTOR蛋白的表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與IH21+IR組比較，抑制劑組大鼠mTOR蛋白的表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。5、beclin1免疫組化和RT-PCR分析結(jié)果：免疫組化結(jié)

14、果：beclin1免疫組化染色呈棕黃色，定位于細(xì)胞胞漿中，主要表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞中；UC組偶見(jiàn)免疫陽(yáng)性細(xì)胞，淡染，神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)正常，核仁明顯；與UC組比較，IR組大鼠6h、24h染色均增強(qiáng)，免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與 IR組比較，各組間歇性低氧+腦缺血組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)（6h、24h）染色增強(qiáng)，免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與 IH7+IR組比較，IH14+IR組、IH21

15、+IR組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)（6h、24h）染色增強(qiáng)，免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與 IH14+IR組比較，IH21+IR組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)（6h、24h）染色減弱，免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與 IH21+IR組比較，抑制劑組大鼠染色增強(qiáng)，免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RT-PCR分析結(jié)果：與 UC組比較，IR組大鼠在在各時(shí)間點(diǎn)（6h、24h）beclin1蛋白的表達(dá)

16、明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與 IR組比較，各組間歇性低氧+腦缺血組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)（6h、24h）beclin1蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與 IH7+IR組比較，IH14+IR組、IH21+IR組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)（6h、24h） beclin1蛋白的表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與 IH14+IR組比較，IH21+IR組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)（6h、24h）beclin1蛋白的表達(dá)減少，差異