壇紫菜轉(zhuǎn)鱟素基因研究.pdf

1、本研究對(duì)壇紫菜轉(zhuǎn)基因育種涉及的下述三個(gè)方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究：壇紫菜轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng)；GUS基因在壇紫菜葉狀體體細(xì)胞內(nèi)的瞬時(shí)表達(dá)；鱟素基因轉(zhuǎn)化壇紫菜葉狀體體細(xì)胞。研究結(jié)果具體如下。 (1)壇紫菜轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng)研究。本研究比較了源自銀口凹螺、朝鮮花冠小月螺及雜色鮑的海藻解壁酶中瓊膠酶、木聚糖酶、纖維素酶的比活力，研究結(jié)果表明，銀口凹螺和朝鮮花冠小月螺較之雜色鮑更適合作為應(yīng)用于紫菜等紅藻的海藻解壁酶的酶源生物；本研究結(jié)果表明，細(xì)胞密度、光

2、照強(qiáng)度、培養(yǎng)液比重對(duì)壇紫菜葉狀體體細(xì)胞的發(fā)育分化具有顯著影響；本研究結(jié)果表明，體細(xì)胞對(duì)氯霉素很敏感，表明氯霉素可作為篩選壇紫菜轉(zhuǎn)基因植株的有效選擇壓力。 (2)GUS基因在壇紫菜葉狀體體細(xì)胞內(nèi)的瞬時(shí)表達(dá)研究。以電穿孔法將質(zhì)粒pBI221導(dǎo)入壇紫菜葉狀體體細(xì)胞內(nèi)，組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，電擊培養(yǎng)72h、6d的轉(zhuǎn)化組體細(xì)胞內(nèi)GUS基因進(jìn)行了瞬時(shí)表達(dá)，表達(dá)效率分別為1.1×10-6、1.3×10-6；熒光分光光度檢測(cè)表明，電擊培養(yǎng)2d-

3、5d的轉(zhuǎn)化組體細(xì)胞的GUS比活力都顯著大于對(duì)照組的，表明GUS基因進(jìn)行了瞬時(shí)表達(dá)。上述結(jié)果表明，本研究建立的壇紫菜葉狀體體細(xì)胞外源基因轉(zhuǎn)化體系是有效的。 (3)鱟素基因轉(zhuǎn)化壇紫菜葉狀體體細(xì)胞研究。本研究構(gòu)建了鱟素Ⅰ基因同源重組表達(dá)載體，利用電穿孔法將其導(dǎo)入壇紫菜葉狀體體細(xì)胞。通過PCR、PCR-Southern雜交、Southern雜交等分子生物學(xué)檢測(cè)方法對(duì)導(dǎo)入后的植株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明鱟素Ⅰ基因已成功整合到基因組內(nèi)。本研究首次

4、將鱟素Ⅰ基因成功轉(zhuǎn)入并整合到壇紫菜體細(xì)胞基因組內(nèi)，Northern點(diǎn)雜交檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步表明鱟素Ⅰ基因在RNA水平得以表達(dá)。本研究推進(jìn)了紫菜轉(zhuǎn)基因抗病育種的進(jìn)展，并為紫菜轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器的研究工作提供了可資借鑒的基礎(chǔ)資料。此外，本研究結(jié)果還表明，以壇紫菜18SrDNA的460bp、1200bp的序列分別作為外源基因3'端和5'端同源重組序列，同時(shí)以家蠶的MARs序列作為增強(qiáng)表達(dá)序列，有利于鱟素Ⅰ基因在壇紫菜葉狀體體細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化、整合、表達(dá)