CXCR-4基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合VCAM-1抗體包被促MSCs歸巢及其對實驗性IBD小鼠腸黏膜修復機制研究.pdf

1、研究背景:炎癥性腸病（IBD）是一類腸道非特異性炎癥疾病，主要包括未定型結(jié)腸炎(Indeterminate Colitis)、漬瘍性結(jié)腸炎(UC)及克羅恩病(CD)。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)是發(fā)生于骨髓中一種非造血類的干細胞，具有容易獲取及無倫理學障礙、再生與多向分化潛能、低免疫原性及免疫調(diào)節(jié)等眾多優(yōu)點，且具有促進IBD損傷腸黏膜愈合并矯正黏膜免疫功能異常的作用，因而成為干細胞治療IBD的首選細胞。前期的實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)靜脈移植的BMS

2、Cs遷移并定植于病變腸道的數(shù)量有限，限制了其治療作用的發(fā)揮。由于干細胞的歸巢行為涉及多種趨化因子及其受體，黏附分子對等的參與。研究表明趨化因子CXC亞組受體-4/基質(zhì)細胞衍生因子-1(CXCR4/SDF-1)與血管細胞粘附分子-1/人遲現(xiàn)抗原-4(VCAM-1/VLA-4)分子對在促干細胞歸巢中發(fā)揮著十分重要的作用。故利用CXCR-4基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合VCAM-1抗體包被BMSCs，能夠使其在體內(nèi)實現(xiàn)治療的靶向性和高效性。
　　實驗目的

3、:通過構(gòu)建CXCR-4基因修飾BMSCs、VCAM-1抗體包被BMSCs及CXCR-4基因修飾聯(lián)合VCAM-1抗體包被BMSCs，來提高BMSCs在移植治療實驗性IBD小鼠模型中的局部定植率及療效，并探討其促進腸黏膜愈合的機制，為臨床上采取何種靶向方式治療IBD提供理論依據(jù)。
　　實驗內(nèi)容:
　　1、探討B(tài)MSCs移植治療實驗性IBD小鼠促損傷腸黏膜修復的免疫機制。
　　2、構(gòu)建并鑒定BMSCs、CXCR-4、VCAM

4、-1靶向性及雙重靶向性BMSCs及評估其體外遷移率。
　　3、觀察CXCR-4及VCAM-1能否促靶向性BMSCs向IBD小鼠損傷腸黏膜定向遷移并加快腸黏膜愈合。
　　4、探討靶向性BMSCs通過何種機制在腸道局部大量定植并發(fā)揮修復作用。
　　實驗方法:
　　1、利用前期研究留取的實驗性IBD小鼠及經(jīng)BMSCs治療后的血清標本，采用流式細胞技術檢測Th1相關細胞因子IL-2、IFN-γ及TNF-α，Th2相關細胞

5、因子IL-4、IL-10及Th17相關細胞因子IL-6、IL-17的水平。
　　2、利用前期研究留取的實驗性IBD小鼠及經(jīng)BMSCs治療后的腸道組織標本，采用Real time PCR及流式細胞技術檢測Th1/Th2/Th17相關細胞因子的水平。
　　3、采用Real time PCR及Western Blot技術檢測腸道組織內(nèi)Th1的主要調(diào)控因子T-bet、Th2的主要調(diào)控因子GATA-3、Th17的主要調(diào)控因子ROR-γ

6、t及Treg相關細胞因子TGF-β及主要調(diào)控因子Foxp3、Smad2的RNA及蛋白的表達情況。
　　4、采用骨片法從雄性BALB/C小鼠（2-3周齡）的骨片中分離并體外培養(yǎng)BMSCs（標記為MSC組）;將攜帶CXCR-4的慢病毒轉(zhuǎn)柒入BMSCs構(gòu)建成CXCR4-BMSCs（C-MSC組）;利用抗體包被技術將兔抗小鼠VCAM-1抗體包被于BMSCs表面構(gòu)建成VCAM1-BMSCs(V-MSC組);采用基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合抗體包被技術構(gòu)建C

7、XCR4-VCAM1-BMSCs(C-V-MSC組);采用Real time-PCR檢測并比較CXCR-4的表達量;采用Real time-PCR及流式細胞技術檢測并比較VCAM-1的表達量。
　　5、通過四組BMSCs的形態(tài)學觀察、計數(shù)法測定生長曲線、成骨成脂誘導分化鑒定、流式細胞技術檢測BMSCs表面標志物、細胞周期、細胞凋亡及臺盼藍染色法測定活細胞率，來比較四組BMSCs生物學特性的變化。
　　6、通過Transwel

8、l體外向SDF-1及含20％血清培養(yǎng)基遷移的實驗，比較四組BMSCs的遷移率。
　　7、選擇雌性BALB/C小鼠（6-8周齡），分別隨機分為6組;并將構(gòu)建好的四組BMSCs標記CM-Dil示蹤:(1)對照組（標記為Control, Ctr組）:生理鹽水灌腸（100μl/只），灌腸后第2天，給予尾靜脈注射不合BMSCs的PBS0.1ml，n=21;(2) TNBS組（T組）:2.0mgTNBS/50％乙醇灌腸劑（100μl/只），并

9、于造模后第2天，給予尾靜脈注射不含BMSCs的PBS0.1ml，n=21;(3) TNBS-MSC移植組（MT組）:2.0mgTNBS/50％乙醇灌腸劑（100μl/只），并于造模后第2天，尾靜脈注射含BMSCs（1×106/只）的PBS0.1ml，n=21;(4) TNBS-C-MSC移植組（CMT組）:2.0mgTNBS/50％乙醇灌腸劑（100μl/只），并于造模后第2天，給予尾靜脈注射含CXCR4-BMSCs（1×106/只）的

10、PBS0.1ml，n=21;(5)TNBS-V-MSC移植組（VMT組）:2.0mgTNBS/50％乙醇灌腸劑（100μl/只），并于造模后第2天，給予尾靜脈注射含VCAM1-BMSCs（1×106/只）的PBS0.1ml，n=21;(6) TNBS-C-V-MSC移植組（CVMT組）:2.0mgTNBS/50％乙醇灌腸劑（100μl/只），并于造模后第2天，給予尾靜脈注射含CXCR4-VCAM1-BMSCs（1×106/只）的PBS0

11、.1ml，n=21。移植當天標記為D0，移植后第1-13天，分別記為D1-13。
　　8、觀察各組小鼠一般情況、體重變化及存活率、進行疾病活動度指數(shù)(TheDisease Activity Index，DAI)評分、放大鏡下管觀察結(jié)腸大體形態(tài)、測量結(jié)直腸長度及進行組織病理學。
　　9、分別于D0、D1、D3、D5、D7、D9、D11、D13天，脫頸處死小鼠3只/組，并取材血液、腸道組織、腸系膜淋巴結(jié)及脾臟，一部分進行石蠟包埋

12、，一部分經(jīng)液氮速凍后，-80℃冰箱保存。
　　10、熒光顯微鏡下觀察BMSCs在腸道內(nèi)的定植情況，及Real time PCR檢測并比較Y染色體的性別決定區(qū)段(SRY)基因的腸道局部的相對量。
　　11、采用免疫組織化學檢測細胞增殖核抗原Ki67、血管生成指標eNOS、腸道上皮間的緊密連接蛋白Claudin-1及JAM-1的表達情況。
　　12、采用Western Blot技術檢測溶菌酶(Lysozyme)、TLR-4

13、、MyD88、TRAF-6、ERK1/2、JNK1/2、MAPK及NF-κB的表達情況。
　　13、采用流式細胞技術檢測腸道組織VCAM-1(CD106)的表達情況。
　　14、采用Elisa技術檢測腸道組織VLA-4的表達情況。
　　實驗結(jié)果:
　　1、血清中Th1相關促炎性細胞因子(IL-2、IFN-γ及TNF-α)和Th17相關促炎性細胞因子（IL-6及IL-17）的水平在造模組中明顯升高;在BMSCs移植

14、組中明顯降低。Th2相關抑炎性細胞因子(IL-4及IL-10)的水平在造模組中無明顯變化，在BMSCs移植組中明顯升高。
　　2、局部腸道組織中Th1、Th17相關促炎性細胞因子的水平在造模組中明顯升高;在BMSCs移植組中明顯降低。Th2相關抑炎性細胞因子及Treg相關抑炎性細胞因子(TGF-β)的水平在造模組中無明顯變化，在BMSCs移植組中明顯升高。
　　3、局部腸道組織中調(diào)控因子T-bet(Th1)及ROR-γt(T

15、h17)的表達在造模組中明顯升高;在BMSCs移植組中明顯降低。GATA-3(Th2)和Foxp3(Treg)的表達在造模組中無明顯變化，Smad2(Treg)的表達在造模組中降低;在BMSCs移植組中明顯升高。
　　4、將CXCR-4基因孚入BMSCs后，可檢測到C-MSC組高表達CXCR-4;將VCAM-1抗體包被于BMSCs后，可檢測到V-MSC組高表達VCAM-1;將VCAM-1包被于CXCR-4轉(zhuǎn)染的BMSCs后，可檢測

16、到C-V-MSC組同時高表達CXCR-4及VCAM-1，且CXCR-4的表達量高于C-MSC組，VCAM-1的表達量高于V-MSC組。
　　5、觀察四組BMSCs均呈長梭形并束狀排列;生長曲線均為S形;成脂肪轉(zhuǎn)化率均在60％左右;骨結(jié)節(jié)的個數(shù)在20個左右/視野;細胞表型鑒定未發(fā)生改變(CD105+，CD90+，CD11b-，CD45-);活細胞比率均在90％以上;以上結(jié)果無明顯的差異;在細胞周期檢測中發(fā)現(xiàn)過表達CXCR-4的BMS

17、Cs復制期增多;在細胞凋亡檢測中發(fā)現(xiàn)V-MSC組及C-V-MSC組細胞凋亡率增加。
　　6、體外遷移實驗證實:在SDF-1的誘導下，C-MSC組的遷移率＞C-V-MSC組＞V-MSC組＞MSC組;在20％FBS誘導下，C-V-MSC組的遷移率＞C-MSC組＞V-MSC組＞MSC組。
　　7、TNBS誘導的實驗性IBD模型，小鼠精神狀態(tài)差、體重減輕及存活率明顯下降，DAI及組織病理學評分明顯上升，肉眼觀察見結(jié)直腸明顯縮短、縮窄

18、，伴有充血、出血，病理見糜爛、潰瘍形成、大量中性粒細胞浸潤于黏膜及黏膜下層，與正常組比較均有明顯差異;MT組、CMT組、VMT組及CVMT組移植后第2天，與T組相比，臨床癥狀好轉(zhuǎn)、體重及存活率開始上升，DAI及組織病理學評分下降，肉眼觀察結(jié)直腸充血、出血及縮窄情況減輕;CVMT組癥狀緩解、體重恢復及組織病理學改變較其他治療組快。
　　8、熒光顯微鏡下可見MT組、CMT組、VMT組及CVMT組的結(jié)腸組織均存在紅色熒光;四組BMSCs

19、移植組及雄性組的腸道黏膜組織中均能檢測到SRY基因;體內(nèi)定植率C-V-MSC組＞C-MSC組＞V-MSC組＞MSC組。
　　9、免疫組織化學染色結(jié)果顯示:IBD模型小鼠接受BMSCs移植后，腸黏膜內(nèi)Ki67、eNOS、Claudin-1及JAM-1的表達量較未接受BMSCs移植組有所升高。
　　10、Western Blot的結(jié)果顯示:TLR-4、MyD88、TRAF-6及NF-κ3在T組(D0)中表達量增加，MT、CMT、

20、VMT及CVMT組D3天腸道組織內(nèi)TLR-4、MyD88、TRAF-6及NF-κB的表達量較T組均下降，尤其以CVMT組下降最明顯。Lysozyme在T組中表達量下降，治療組均升高，以CMT組及VMT組升高明顯。ERK1/2及JNK1/2在T組中相對表達量下降，MAPK的表達量升高;與T組相比，MT組、CMT組、VMT組及CVMT組，ERK1/2及JNK1/2的蛋白表達量均升高，MAPK蛋白的表達量降低，以CVMT組降低最為明顯。

21、>　　11、檢測腸道內(nèi)VCAM-1/VLA-4的含量結(jié)果顯示:Control組為41.75％;T組下降為18.73％; BMSCs移植組不同程度地升高，CVMT組(73.51％)＞VMT組(67.10％)＞CMT組(66.55％)＞MT組(51.42％)。Control組中含有一定量的VLA-4，D3天時，T組升高;MT、CMT、VMT及CVMT組較T組的含量減少，減少程度為CVMT組＞VMT組＞CMT組＞MT組;D7天時含量基本恢復正

22、常，無差異。
　　實驗結(jié)論:
　　1、BMSCs能夠通過抑制促炎性細胞因子、促進抑炎性細胞因子的分泌及恢復Th1/Th2及Th17/Treg細胞的平衡，來調(diào)控實驗性IBD小鼠的全身及局部免疫狀態(tài)。
　　2、利用CXCR-4基因轉(zhuǎn)柒及VCAM-1抗體包被BMSCs，幾乎不會改變BMSCs的生物學活性，且二者在BMSCs表面可協(xié)同表達。
　　3、體內(nèi)外實驗均證實了靶向組BMSCs的遷移率增加，且CXCR-4及VCAM