3-巰基丙酮酸轉硫酶在非酒精性脂肪性肝病中的作用及其分子機制研究.pdf

1、背景和目的:
　　肝臟中脂肪酸的過度沉積會通過脂毒性導致非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfatty liver disease，NAFLD)的發(fā)生發(fā)展，但其中涉及的分子機制尚不明確。胱硫醚-β-合酶(cystahionine-β-synthase，CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)是體內內源性硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)的主要產生酶，已被發(fā)現(xiàn)受到脂肪

2、酸的調控并參與NAFLD發(fā)病機制。本研究旨在探究另一內源性H2S產生酶，3-巰基丙酮酸轉移硫酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，MPST)在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的作用及機制。
　　材料和方法:
　　采用游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）（油酸∶棕櫚酸為2∶1）混合培養(yǎng)液刺激人正常肝細胞L02細胞，及高脂飲食（high fat diet，HFD）喂養(yǎng)C57BL/6小鼠

3、分別建立NAFLD細胞及動物模型，用Western Blot法檢測MPST在NAFLD模型中的表達水平。采用免疫組化法檢測MPST在NAFLD臨床患者肝臟標本中的蛋白表達水平。采用重組腺病毒介導shRNA結合尾靜脈高壓注射技術對小鼠體內肝臟MPST的表達進行干預，并在借助轉錄激活樣效應因子核酸酶(transcriptionactivator-like effector nuclease，TALEN)技術構建的C57BL/6為背景的MPS

4、T基因敲除雜合子小鼠中進一步觀察MPST對肝臟脂肪變性的影響作用。在FFA刺激的L02細胞中，分別運用siRNA和轉染MPST過表達質粒以干預MPST表達，觀察MPST對肝細胞脂肪變性的影響與作用。采用H&E及油紅O染色觀察肝臟和肝細胞脂變程度，通過測定肝甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)含量及FFA水平，聯(lián)系H2S水平變化，MDA及SOD活性等指標變化研究MPST對肝臟脂肪變性及氧化應激的影響。通過外源性H2S供體的應用，檢測CSE及

5、SREBP-1通路、JNK磷酸化水平變化，免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，CoIP)技術探究潛在的分子機制。
　　結果:
　　FFA的刺激誘導MPST在人脂變肝細胞中表達上調，并部分依賴于NF-κB/p65。在HFD誘導的小鼠NAFLD模型及臨床NAFLD患者肝臟中，MPST蛋白表達水平顯著升高。應用MPST-shRNA重組腺病毒尾靜脈高壓注射介導小鼠肝臟MPST表達部分敲低，和使用MPST基因敲除

6、雜合子小鼠介導遺傳性的MPST表達部分缺失，均能顯著改善HFD誘導的肝臟脂肪變性程度。和體內水平一致地，在L02細胞中抑制MPST表達后，F(xiàn)FA誘導的肝細胞脂變顯著改善，而過表達MPST后則脂變加劇。有趣的是，部分敲低MPST會顯著上調H2S水平，相反地，過表達MPST則顯著下調H2S水平。CoIP實驗揭示MPST可以通過直接蛋白-蛋白相互作用而負調控CSE—肝臟中H2S產生主要酶。且進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)，H2S在MPST對脂肪肝的調節(jié)