加味澤瀉湯對NAFLD小鼠腸道微生物干預作用的研究.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是除外酒精和其他明確的損肝因素所致的脂肪在肝臟堆積所產生的以彌漫性肝細胞大泡性脂肪性變?yōu)橹饕∽兊呐R床病理綜合征，包括單純性脂肪肝(SFL)、脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化。該病在全球及中國呈現高發(fā)病率，中國約將近一半的肝臟疾病患者是NAFLD患者。伴隨著我國肥胖、代謝綜合征及糖尿病的高發(fā)病率，NAFLD的發(fā)病率逐年升高。目前臨床在治療上沒有有效而證據指數高的藥物，中醫(yī)藥在脂肪肝、高脂血癥及肥胖的治療中具

2、有一定的優(yōu)勢。尋找有效安全的NAFLD中醫(yī)藥治療方法并對其治療機制進行探索具有重要意義。非酒精性脂肪肝從中醫(yī)角度認為是脾虛不運，痰濁內阻為病，因此臨床上主要采用健脾泄?jié)岱ㄟM行治療，臨床上我們采用《金匱》澤瀉湯加熟大黃治療。
　　目的:1.通過文獻研究分析近10年臨床治療NAFLD的用藥規(guī)律;2.通過評估不同脂肪含量的高脂純化飼料尋找有效、重復性高的NAFLD建模飼料;3.通過低、中、高劑量的加味澤瀉湯治療NAFLD小鼠，選擇最佳的

3、治療劑量;4.通過宏基因組學的方法探討腸道微生物在加味澤瀉湯治療NAFLD小鼠中的潛在機制;5.通過急性毒理實驗對加味澤瀉湯的毒性進行評估;6.通過高效液相色譜串聯質譜(UPLC-MS)對水煎劑加味澤瀉湯及物質基礎進行分析，建立質控標準。
　　方法:1.檢索2004年至2014年中醫(yī)藥治療NAFLD的臨床文獻，通過用藥頻次分析臨床中治療NAFLD的病機及用藥規(guī)律;2.采用45％及60％脂肪含量高脂純化飼料建立NAFLD小鼠，通過一

4、般情況、血脂血糖、糖耐量實驗及肝臟病理評估兩種飼料的造模程度，對建模飼料進行選擇;3.采用低、中、高劑量的加味澤瀉湯對高脂飲食誘導的NAFLD小鼠進行干預，通過一般情況、血糖血脂、糖耐量實驗及肝臟病理評估不同劑量對NAFLD小鼠的治療效應;4.采用加味澤瀉湯對NAFLD小鼠進行治療，檢測肝功能、肝臟HE及Masson染色、RT-qPCR法檢測肝內炎癥因子表達水平、免疫組化及western-blotting檢測回腸結腸中緊密連接蛋白occ

5、ludin蛋白表達、高通量測序法檢測小鼠糞便16S rRNA分析糞便微生物，挖掘加味澤瀉湯的潛在治療機制;5.給予雌雄小鼠最大給藥劑量的加味澤瀉湯7天，觀察是否死亡、體重及重要臟器病理，對加味澤瀉湯進行急性毒理評估;6.通過UPLC-MS對水煎劑加味澤瀉湯及物質基礎進行分析，比對蒼術酮、大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素及2，3-乙酰澤瀉醇B等對照品，并通過質譜圖譜對其他物質進行鑒定分析。
　　結果:1.文獻研究中，我們對近10年來非酒精

6、性脂肪肝的臨床文獻進行用藥頻次及規(guī)律研究，共檢索出藥物147種治療藥物，藥物總是使用頻次為960次。高頻使用的藥物主要為丹參7.57％、山楂7.03％、澤瀉5.95％、柴胡5.73％、茯苓4.97％、白術4.11％、決明子4.11％等，按功能主要歸于利水滲濕藥、補虛藥及活血化瘀藥。從用藥角度證實非酒精性脂肪肝脾運不健，痰濁內阻的病機，及運用健脾泄?jié)岱ㄖ委煹暮侠硇浴?br>　　2.對不同脂肪含量攝入的高脂飲食誘導NAFLD小鼠模型實驗中，

7、45％與60％脂肪含量高脂純化飼料均能出現體重增加、肝臟及脂肪重量增加、血脂血糖異常、胰島素抵抗、肝臟呈現脂肪變，顯示這兩種飼料均能較好的誘導出NAFLD小鼠模型，兩者差異不顯著，認為45％脂肪含量飼料已能滿足實驗需要。
　　3.在低、中、高劑量加味澤瀉湯治療NAFLD小鼠的效應研究中，經4周治療加味澤瀉湯可顯著減輕NAFLD小鼠血清AST、肝臟及病理評分，在體重、血清ALT、TC、TG、HDL-C、LDL-C方面有一定改善趨勢，

8、但是無統計學差異。在低、中、高三個劑量組中，以低劑量與中劑量組整體治療效果更好。整體結果顯示，雖然加味澤瀉湯在改善NAFLD小鼠體重、胰島素抵抗及血脂有一定效果，但在其在改善肝內炎癥反應的效應更佳，這對我們的機制探討具有指導意義。
　　4.對加味澤瀉湯治療NAFLD小鼠治療的機制探討中，主要注重于腸道微生物-腸道屏障-肝內炎癥反應的研究。結果顯示，(1)加味澤瀉湯可減輕血清AST水平，改善肝臟組織炎癥性改變，減少肝臟內膠原纖維沉積

9、，減小脂肪細胞體積。(2)加味澤瀉湯可降低由高脂模型誘導的肝臟內炎癥因子的高表達，可降低IL-1β、TNFα及F4/80mRNA的表達，具有統計學意義;具有降低TLR4、NLRP3mRNA表達量的趨勢;對IL-10、IL-18、Caspase-1表達無作用。(3)對腸粘膜屏障完整性具有重要意義的緊密連接蛋白occludin的表達，加味澤瀉湯對回腸、結腸未改變基本結構;在回腸與結腸的免疫組化及western-blotting中，模型組oc

10、cludin表達量顯著下降，加味澤瀉湯治療后可回復其表達。(4)在對腸道微生物16SrRNA豐度、多樣性的研究中，Ace指數模型組較空白組下降，給藥組較空白組也下降;Chao指數，模型組較空白組下降，給藥組較空白組下降;Shannon指數模型組較空白組下降，給藥組較空白組下降;Simpson指數模型組較空白組升高，給藥組較模型組指數有所下降，提示模型組及藥物組較空白組腸道微生物豐度及多樣性下降。(5)在門的分類學水平上，高脂飲食及加味澤

11、瀉湯的運用均能造成腸道微生物組成的較大;擬桿菌門(Bacteroidetes)在模型組較空白組升高，加味澤瀉湯組較空白組Bacteroidetes升高;厚壁菌門（Firmicute）在模型組及給藥組均出現了下降;變形菌門(Proteobacteria)在模型組出現升高，經加味澤瀉湯干預后占比下降，此外脫鐵菌門(Deferribacteres)也出現了與Proteobacteria一樣的變化。(6)在屬的分類學水平上，脫硫弧菌屬(Desu

12、lfovibrio) OTU數量在模型組顯著增長，經加味澤瀉湯治療后下降到與空白組一致的水平;普雷沃氏菌屬(Prevotella)在模型組數量增加，加味澤瀉湯治療后可降低其數量;在羅氏菌屬(Roseburia)及Lachnospiraceae_Incertae_Sedis屬的數量表現也與Desulfovibrio、Prevotella一致。
　　5.通過對加味澤瀉湯的急性毒性實驗，確定其毒理反應，以最大濃度最大容量灌胃給藥，連續(xù)觀

13、察7d。結果顯示，無動物死亡、無中毒反應，肝臟及腎臟病理改變。加味澤瀉湯最大受試劑量是臨床常規(guī)劑量的111倍，認為加味澤瀉湯無明顯急性毒理反應。
　　6.通過對加味澤瀉湯物質基礎的研究，結果顯示，(1)根據色譜峰比對蒼術酮、大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素及2，3-乙酰澤瀉醇B的對照品及加味澤瀉湯中的物質，加味澤瀉湯中存在及大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素及2，3-乙酰澤瀉醇B，但未找到蒼術酮的色譜峰。(2)結合質譜圖譜分析，加味澤瀉湯中除以

14、上物質外，還可能存在沒食子酸、大黃酚、大黃素甲醚、澤瀉醇A醋酸酯、澤瀉醇C單乙酸酯、澤瀉醇B、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ。(3)對照品中找白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ的色譜峰，考慮蒼術酮經氧化可轉化為白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ。
　　結論:結合文獻研究及實驗研究，加味澤瀉湯藥符合NAFLD病機，其主要物質基礎均具有一定的降脂及改善肝臟炎癥的作用，加味澤瀉湯對高脂誘導的NAFLD小鼠具有良好的治療的效果，可能通