DNA和凝血酶熒光分析新方法的研究.pdf

1、核酸是生命的遺傳物質(zhì)，蛋白質(zhì)是生命的體現(xiàn)者。人類許多遺傳疾病與DNA堿基序列的變異有關(guān)，人體中特定蛋白質(zhì)濃度也可以作為疾病診斷的依據(jù)，因此，建立高靈敏度、高選擇性、簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)特定序列DNA和蛋白質(zhì)的分析方法，對(duì)疾病診斷和預(yù)防具有重要的意義。熒光分析方法因其高靈敏度、高選擇性、簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)，已在生命分析中得到廣泛的應(yīng)用。 本論文由綜述和研究報(bào)告兩部分組成。第一部分介紹了熒光分析方法的原理及特點(diǎn)，簡(jiǎn)要評(píng)述了DNA、蛋白質(zhì)檢測(cè)

2、方法的研究進(jìn)展。以熒光納米粒子為重點(diǎn)介紹了常見(jiàn)的熒光標(biāo)記物，最后闡述了本論文的研究目的和內(nèi)容。 第二部分為研究報(bào)告，由兩部分組成。第一部分以異硫氰酸羅丹明B嵌合二氧化硅納米粒子為熒光信號(hào)物質(zhì)構(gòu)建納米熒光核酸探針，使其與固定在磁性納米粒子上的目標(biāo)單鏈DNA雜交，經(jīng)磁場(chǎng)分離后測(cè)量沉淀物的熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該熒光強(qiáng)度與目標(biāo)單鏈DNA的濃度在1.3×10<'-14>～2.5×10<'-13>mol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為I

3、=40.1C+10.1(C的單位為10<'-13>mol/L)，相關(guān)系數(shù)為0.9968。對(duì)6.7×10<'-14> mol/L濃度的目標(biāo)單鏈DNA進(jìn)行11次測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6％。方法的檢出限為1.6×10<'-15>mol/L。本研究結(jié)合納米技術(shù)及生物磁場(chǎng)分離技術(shù)通過(guò)磁性材料標(biāo)記生物分子實(shí)現(xiàn)了磁性分離，結(jié)合分子識(shí)別技術(shù)，通過(guò)磁性材料標(biāo)記生物分子實(shí)現(xiàn)了磁性分離，提高了分離的選擇性。建立了一種高靈敏的DNA雜交熒光檢測(cè)方法，對(duì)DNA

4、分析方法的研究具有一定的參考價(jià)值。 研究報(bào)告的第二部分提出了基于競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的非標(biāo)記熒光蛋白質(zhì)檢測(cè)方法。以凝血酶為檢測(cè)對(duì)象，使用能夠?qū)Ｒ唤Y(jié)合凝血酶的核酸適體作為識(shí)別分子，設(shè)計(jì)了含AP位點(diǎn)的適體的互補(bǔ)DNA，建立了高選擇性熒光檢測(cè)凝血酶的新方法。沒(méi)有凝血酶時(shí)，核酸適體可以和內(nèi)含AP位點(diǎn)單鏈DNA最大程度地雜交形成雙鏈DNA，熒光分子氨氯吡咪嵌合在雙鏈：DNA中的AP位點(diǎn)處并與．AP位點(diǎn)對(duì)面堿基T結(jié)合，使得氨氯吡咪的熒光信號(hào)下降；當(dāng)凝血

5、酶存在時(shí)，凝血酶競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合其適體，釋放出雙鏈中嵌在堿基缺失位點(diǎn)(AP site)的熒光報(bào)告分子氨氯吡咪，熒光信號(hào)增強(qiáng)，并且熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)程度與凝血酶濃度呈線性關(guān)系。據(jù)此，可基于熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)來(lái)對(duì)凝血酶進(jìn)行定量測(cè)定。在選定實(shí)驗(yàn)條件下，檢測(cè)凝血酶的線性范圍為4.2×10<'-9>～4.2×10<'-8>mol/L，線性方程為△I=0.0204C-0.0251(C的單位：10<'-9>mol/L)，相關(guān)系數(shù)為0.9962，對(duì)3.0×10<'-8