TNF-α基因shRNA影響脊柱結核破骨細胞形成的實驗研究.pdf

1、目的：
　　構建靶向TNF-α基因的shRNA載體，觀察其對脊柱結核破骨細胞形成的影響，為后續(xù)脊柱結核骨質(zhì)破壞的干預性研究奠定基礎。
　　方法：
　　結核菌素純蛋白衍生物（PPD）誘導小鼠RAW264.7細胞，采用細胞增殖與毒性（CCK）試驗檢測PPD對細胞增殖的影響，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色觀察破骨細胞的形成，比較不同劑量（0、2、20、50、100μL）及誘導時間（1、4、7天）條件下，破骨細胞形成的差異

2、。通過qPCR和Western Blotting檢測PPD誘導1、4、7天TNF-α的表達。雙酶切法構建靶向TNF-α基因的shRNA，經(jīng)脂質(zhì)體轉染RAW264.7細胞，熒光顯微鏡下觀察轉染效率，RT-PCR觀察轉染后1、3、5、7天TNF-α基因的表達，收集轉染后第三天的細胞，qPCR檢測轉染后TNF-α和RANK基因的表達，Western Blotting檢測TNF-α蛋白的表達，TRAP染色計數(shù)轉染后第7天破骨細胞形成的數(shù)量。

3、r>　　結果：
　　PPD抑制RAW264.7細胞的增殖；TRAP染色可見破骨細胞形成；不同劑量PPD誘導破骨細胞形成的數(shù)量：PPD0μL組為（1.67±0.58）個、2μL組（4.67±0.58）個、20μL組（16.67±0.52）個、50μL組（10.67±2.89）個、100μL組（1.33±0.58）個；20μL PPD誘導1、4、7天破骨細胞形成的數(shù)量：1天組為（1.50±0.55）個、4天組為（7.50±1.87）個

4、、7天組為（17.33±2.07）個；PPD誘導1、4、7天TNF-α基因的表達量為：對照組：（1±0），1天組：（4.267±0.737），4天組：（13.60±0.648），7天組：（14.07±1.013），TNF-α蛋白的表達量，對照組為：（0.066±0.004）,1天組：（0.081±0.005）,4天組：（0.162±0.003）,7天組：（0.179±0.005）；轉染前后TNF-α基因的表達量：轉染前為（1.426±0

5、.086），轉染后為（0.464±0.029）；轉染前后RANK基因的表達量：轉染前為（1.393±0.007），轉染后為（1.154±0.006）；轉染前后TNF-α蛋白的表達量：轉染前為（82.72±1.843），轉染后為（55.34±0.824）；轉染前后破骨細胞形成的數(shù)量：轉染前為（56.67±3.786）個，轉染后為（19.33±1.528）個。
　　結論：
　　PPD可以誘導破骨細胞形成，且破骨細胞形成與PPD之