棘胸蛙蝌蚪與幼蛙肌肉蛋白質組初步研究.pdf

1、棘胸蛙是一種主要分布在我國南方各省山區(qū)的大型經濟蛙類。具有極高的食用和經濟價值，對其進行蛋白質組學的研究意義重大。 [目的]采用蛋白質組研究技術，通過雙向電泳分離、比較棘胸蛙蝌蚪與幼蛙肌肉組織的蛋白質表達差異，通過質譜檢測分析的差異蛋白質點。尋找與鑒定棘胸蛙蝌蚪變態(tài)發(fā)育為幼蛙時期的肌肉組織存在的蛋白質差異表達，這些存在的差異蛋白質可能與棘胸蛙變態(tài)發(fā)育有著密切的關系，在動物發(fā)育生物學研究領域內具有較高的學術價值。 [方法]

2、本研究是建立在蛋白質雙向電泳(2-DE)技術和優(yōu)化各類實驗技術的基礎上，采用2-DE聯合串聯質譜(MS-MS)的技術路線進行了棘胸蛙蝌蚪與幼蛙肌肉組織的蛋白質組學初步研究。一步法和標本混合法提取棘胸蛙蝌蚪與幼蛙肌肉組織的總蛋白質；以Bradford測定法繪制蛋白定量標準曲線，對肌肉組織樣品蛋白提取物定量；肌肉組織蛋白質提取物以相同加樣量進行雙向凝膠電泳；一向等電聚焦，使用固相pH梯度凝膠條(IPGstritpH3-10NL)，膠內重泡脹

3、技術，聚焦總電壓時80kVh-85kVh；用DTT(二硫蘇糖醇)和碘乙酰胺兩步平衡；二向電泳采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(13％、1.5mm均一膠)；根據上樣量不同分別進行銀染和考馬斯亮藍染色；用ImageScanner光密度掃描儀(AmershamPharmacia公司產品)獲取染色后的2-DE凝膠圖譜；將2-DE凝膠圖譜輸入計算機，通過PDQuest軟件分析找到合適的差異蛋白質點；ABI4700TOF-TOF質譜儀鑒定與分析所

4、找出的差異蛋白質點，得到差異蛋白質的肽質量指紋(PMF)和肽序列標簽(PST)；用Matrixscience公司的Mascot軟件搜索NCBInr數據庫，對得到的PMF和PST與數據庫進行蛋白同源查詢，獲取差異蛋白質的信息。結合雙向凝膠電泳相應表觀等電點、分子量、匹配肽段和覆蓋率等進行綜合分析。 [結果]通過一步法和標本混合法提取棘胸蛙蝌蚪和幼蛙肌肉組織的蛋白定量結果分別是11.4084μg/μl、10.9956μg/μl。PD

5、Quest軟件分析雙向電泳圖譜結果，兩個圖譜對比共有差異點42±5個。對其中10個蛋白質點進行質譜分析，通過對NCBInr數據庫檢索，再通過表觀等電點、分子量、匹配肽段和覆蓋率等分析得到6個不同的蛋白信息：P1為troponinT3，P2、P3、P6、P7、為fasttroponinT，P4為Aldh-Aprotein，P5為creatinekinase(EC2.7.3.2)-Africanclawedfrog(fragment),P8

6、為Enigma-provprotein,P9、P10為Ckm-provprotein。 [結論](1)建立了良好的棘胸蛙肌肉蛋白提取法，提高了分離效果，對蛋白質斑點的鑒別可提供更多的信息。(2)應用固定pH梯度(IPG)膠條可提高雙向電泳的分辨率和重復性。(3)對比棘胸蛙蝌蚪與幼蛙肌肉組織的蛋白質的雙向電泳圖象分析結果，表明在棘胸蛙蝌蚪的發(fā)育到幼蛙過程中肌肉有顯著的蛋白表達差異。(4)通過生物質譜鑒定的6種表達差異蛋白可能與棘胸