SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp14基因的克隆表達及其作用底物的制備.pdf

1、本研究通過對SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp14基因進行克隆，原核表達得到了Nsp14蛋白，并為Nsp14蛋白功能的檢測制備了底物。 試驗一、SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp14基因的克隆。根據(jù)Genebank公布的SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp14的基因序列設(shè)計引物，用PCR的方法把Nsp14基因從SARS冠狀病毒的cDNA片段中擴增出來，將目標基因連接到原核表達載體(pET30a)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切反

2、應(yīng)進行了初步鑒定，并將初步鑒定后的質(zhì)粒進行測序。測序結(jié)果表明，克隆的Nsp14基因序列與發(fā)表基因完全一致，成功構(gòu)建了原核表達載體pET30a-Exo。 試驗二、對非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp14進行了誘導表達和純化。把構(gòu)建的原核表達載體pET30a-Exo轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，誘導產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后，發(fā)現(xiàn)目的蛋白以包涵體的形式存在。對非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp14的表達和純化條件進行了優(yōu)化。使用多步洗滌的方法對包涵體進行了初步純化