牛蛙生長激素基因克隆及其表達(dá)效應(yīng)研究.pdf_第1頁
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1、四川大學(xué)博士學(xué)位論文牛蛙生長激素基因克隆及其表達(dá)效應(yīng)研究姓名:龍章富申請學(xué)位級別:博士專業(yè):遺傳學(xué)指導(dǎo)教師:劉世貴20030430叫川人學(xué)博I學(xué)位論文Takahashi等(1992)報道的牛蛙GH蛋白序列(AAB24792)的同源性為97%,與Kobalyashi等(1991)報道的牛蛙GH蛋白序歹mJ(AABl9428)的同源性為95%。本研究克隆的牛蛙生長激素基因BfGH已在GenBank登記(AY251538)。采用雙酶切牛蛙GH

2、基因cDNA片斷和原核表達(dá)載體pGEXl一九T,將BfGHcDNA定向插入到pGEXlXT,經(jīng)酶切鑒定后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)研究。表達(dá)研究結(jié)果包括三方面,一是重組pGBfGH在大腸桿菌中表達(dá)的融合蛋白分子量為509KDa,符合推導(dǎo)分析的預(yù)期大??;二是誘導(dǎo)條件的優(yōu)化,在添加ImM/LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)3hrs就能得到高效表達(dá),經(jīng)定量分析,牛蛙生長激素基因在大腸桿菌中的表達(dá)量可達(dá)到菌體總蛋白的293%;通過比較不同誘導(dǎo)時問和不同濃度的誘導(dǎo)劑用

3、量等研究,結(jié)果表明在IPTG濃度為0ImM/L時,37℃誘導(dǎo)表達(dá)4hrs,其表達(dá)量與1mM/L濃度的IPTG,37℃誘導(dǎo)表達(dá)3hrs的表達(dá)量一致,這為大量表達(dá)生產(chǎn)重組牛蛙GH蛋白時降低IPTG用量、從而降低生產(chǎn)成本提供了理論依據(jù)。三是重組BfGH在大腸桿菌中的表達(dá)以形成包涵體的形式存在。通過回收原核表達(dá)的牛蛙GH重組蛋白(reBfGH),并制各抗B好H的兔抗高免血清,采用牛蛙肝受體膜蛋白為吸附受體,以回收的重組牛蛙生長激素融合蛋白為抗原

4、,兔抗BfGH高免血清為一抗,辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗兔IgG(HRP—IgG)為二抗,進(jìn)行ELISA—RA檢測,驗證了回收的重組牛蛙生長激素融合蛋白具有較強(qiáng)的生物活性和免疫活性。以VRl020為載體,構(gòu)建了牛蛙GH真核表達(dá)質(zhì)粒VBfGH、草魚GH真核表達(dá)質(zhì)粒VgcGH,并以脂質(zhì)體為載體進(jìn)行了Cos7細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)實驗。在轉(zhuǎn)染2472hrs后,對抽提的轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA進(jìn)行RTPCR檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染24hrsVBfGH在Cos7細(xì)胞中即有轉(zhuǎn)錄,并

5、在72hrs時轉(zhuǎn)錄量最強(qiáng);以轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)液為抗原進(jìn)行ELISARA檢測。轉(zhuǎn)染24hrs、48hrs、72hrs的牛蛙生長激素表達(dá)量分別為2540ng/ml,5867ng/ml和7347ng/r01。為進(jìn)一步驗證牛蛙重組生長激素蛋白和真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達(dá)對牛蛙的生物活性,進(jìn)行脂質(zhì)體包裹重組reBfGH蛋白、脂質(zhì)體包裹VBfGH質(zhì)粒、脂質(zhì)體包裹草魚GH真核表達(dá)質(zhì)粒VgcGH、脂質(zhì)體包裹VRl020質(zhì)粒對牛蛙體內(nèi)促長效果的比較研究,并以脂質(zhì)體

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