鹽地堿蓬4，5-多巴雙加氧酶基因的克隆和功能分析.pdf

1、鹽地堿蓬是一種葉肉質化的稀鹽鹽生植物。鹽地堿蓬在濱海的潮間帶或者部分澇洼積水地帶在整個生長期植株地上部分皆為紫紅色，而在地勢較高或者距離海邊較遠的地方植株則呈現(xiàn)綠色。作為一種真鹽生植物，鹽地堿蓬的耐鹽機理已得到了比較廣泛的研究。且已證明鹽地堿蓬中的紅色素為甜菜紅素。但是，鹽地堿蓬中甜菜紅素積累的生物學意義至今尚未見報道。目前甜菜素合成的分子機理和相關基因的表達調控也不明晰。甜菜素合成途徑相關酶的功能定位、特性分析、基因克隆以及相關基因表

2、達調控的研究也是需要深入的領域。本實驗克隆了合成甜菜紅素的關鍵酶之一——4,5-多巴雙加氧酶的基因和啟動子，研究其表達特點，為進一步研究甜菜紅素在鹽生植物進化和生態(tài)適應等方面的作用機理奠定了基礎。 研究結果如下： 1.鹽地堿蓬DODA基因克隆及序列分析 根據GeneBank中已知的DODA基因的cDNA和蛋白序列尋找保守區(qū)以合成簡并引物，以鹽地堿蓬總RNA為模板，通過RT-PCR擴增獲得500 bp的保守片段；B

3、LAST分析表明該片段與其它植物DODA同源性較高，初步確定為鹽地堿蓬DODA基因序列；根據該序列設計用于3’-RACE和5’-RACE的基因特異性引物，分別擴增得到350 bp的3’-末端和250 bp的5’-末端；將三段序列進行拼接，獲得鹽地堿蓬基因DODA的全長，進而設計引物擴增獲得其全長。SsDODA cDNA序列全長1030 bp，包括71 bp的5’-非編碼區(qū)和146 bp的3’-非編碼區(qū)。開放閱讀框為813 bp，編碼27

4、1個氨基酸殘基，分子量約30.4kDa。BLAST分析表明鹽地堿蓬4,5-多巴雙加氧酶與來源于其他物種的4,5-多巴雙加氧酶具有較高的序列相似性，與Beta vulgaris在氨基酸水平上具有80％的序列一致性。 2.植物表達載體pROKII：：SsDODA的構建 經Xba I和BamH I酶切的pMD18-T：：SsDODA和pROKII載體通過T4 DNA連接酶連接，連接產物轉經PCR以及酶切鑒定確定為重組質粒，且外

5、源片段方向正確，命名為pROKII：：SsDODA。 3.轉基因擬南芥的篩選 pROKII：：SsDODA轉化農桿菌GV3101，陽性克隆侵染擬南芥。在50 mg/L卡那霉素的篩選壓下，獲得約100株抗性苗。轉化株自交以獲得純合的轉基因株系。 4.SsDODA啟動子的分離和功能預測 使用TAIL-PCR法首次成功地從鹽地堿蓬基因組中克隆了4,5-多巴雙加氧酶基因SsDODA的啟動子片段。使用PLACE數(shù)據

6、庫對500bp的SsDODA啟動子片段進行順式作用元件分析，結果表明啟動子序列中除了TATA-motif、CAAT-motif等典型的真核生物順式調控元件外，還含有其他重要的順式調控元件如光反應元件：-10PEHVPSBD，I box；低溫響應元件LTR；脫水應答元件MYCCONSENSUSAT等。 5.植物表達載體pBII21：：SsDODA-P的構建 HindⅢ和BamH I雙酶切pBII21質粒，去掉約0.8kb的

7、35S啟動子片段，回收大片段，并與同樣經HindⅢ和BamH I雙酶切的SsDODA啟動子片段連接，構建成與報告基因GUS融合的植物表達載體pBII21：：SsDODA-P。 6.SsDODA啟動子的GUS活性檢測 將植物表達載體pBII21：：SsDODA-P轉入根癌農桿菌EHA105，陽性克隆轉化煙草，GUS組織化學檢測結果表明，鹽地堿蓬SsDODA啟動子片段能夠驅動報告基因GUS在煙草葉片中表達，證明克隆得到的Ss