C族G蛋白偶聯(lián)受體激活機(jī)制的精細(xì)研究.pdf

1、C族G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs Family C）(以下簡(jiǎn)稱(chēng)C族受體)包括mGluRs、GABABR、CaSR、TasterR等成員，在體內(nèi)廣泛分布并具有重要的生理功能，其活性受到精密的調(diào)控，并與多種疾病的病理進(jìn)程密切相關(guān)。除了GPCR所共有的參與G蛋白偶聯(lián)的HD以及膜內(nèi)的C末端，C族受體還具有膜外巨大的參與配體結(jié)合的VFT，以及連接HD與VFT之間的CRD。同時(shí)，相對(duì)于其他亞家族受配體誘導(dǎo)的不穩(wěn)定的二聚化，C族受體在體內(nèi)形成組成性的二

2、聚體。
　　 可以想見(jiàn)，結(jié)構(gòu)復(fù)雜的C族C族受體具有復(fù)雜的激活機(jī)制。在大量的研究基礎(chǔ)上，簡(jiǎn)化的基于單體的兩步激活模型得到了廣泛的承認(rèn)。配體結(jié)合到VFT后導(dǎo)致VFT 關(guān)閉，進(jìn)而將激活信號(hào)傳導(dǎo)到HD，構(gòu)象發(fā)生改變后的HD與G蛋白偶聯(lián)從而激活受體。
　　 但是，對(duì)于這一激活過(guò)程中的精細(xì)機(jī)制，還尚不了解。比如VFT是如何將構(gòu)象變化傳導(dǎo)到HD，CRD在其中所扮演的角色，目前還幾乎是空白。而更重要的是，C族受體在體內(nèi)是組成性的二聚體，

3、對(duì)于二聚體在激活過(guò)程中復(fù)雜的構(gòu)象變化以及由之而產(chǎn)生的各功能域間的相互作用和拓?fù)鋵W(xué)效應(yīng)，簡(jiǎn)化的兩步激活模型并不能夠完全解釋。另一方面，功能的重要性和結(jié)構(gòu)上的易操控性，使得C族GPCR成為重要的藥物靶點(diǎn)。因此，對(duì)于C族GPCR激活機(jī)制的精細(xì)研究，在理論和應(yīng)用上都具有重要的意義。
　　 本文研究了異源二聚體GABABR激活過(guò)程中的精細(xì)機(jī)制。我們根據(jù)生物信息學(xué)研究推測(cè)LB1-LB1結(jié)合界面對(duì)于受體的結(jié)構(gòu)形成，以及GABABR的VFT-V

4、FT相互作用具有重要的意義。由此我們根據(jù)構(gòu)建的三維模型在可能的LB1-LB1結(jié)合界面上引入了一系列糖基化位點(diǎn)，進(jìn)而檢測(cè)了突變體的功能變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GB2-N114和GB2-N141失活，并喪失了所有二聚化的生理效應(yīng)；而在同樣位點(diǎn)引入的非糖基化突變GB2-Q114和GB2-Q141則無(wú)相應(yīng)改變。這說(shuō)明引入的糖基化位點(diǎn)所產(chǎn)生的VFT-VFT間的結(jié)構(gòu)阻礙，導(dǎo)致GB1和GB2不能正常二聚化。類(lèi)似的結(jié)果也在GB1中發(fā)現(xiàn)，位于LB1-LB1結(jié)合界

5、面的GB1-N229和GB1-N251突變具有類(lèi)似的生理現(xiàn)象。因此，這些結(jié)果探明了GABABR中VFT-VFT相互作用的精細(xì)位點(diǎn)，并對(duì)GABABR異源二聚化的形成機(jī)制提供了新的證據(jù)。我們還將糖基化突變引入到GB2的LB2底部，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GB2-N209喪失了活性，但突變體并不影響異源二聚化，據(jù)此推測(cè)，該位點(diǎn)的失活與糖基化引入的結(jié)構(gòu)阻礙影響了VFT的構(gòu)象變化以及與HD的偶聯(lián)有關(guān)。
　　 本文在前面工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在CRD中突變了

6、其中嚴(yán)格保守的9個(gè)Cys殘基。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有的突變體均可以正常上膜、二聚化、結(jié)合配體，但其藥物反應(yīng)性質(zhì)均發(fā)生改變，其中mGluR2-C500A產(chǎn)生高組成性活性，mGluR2-C518A激活強(qiáng)度降低，而其余的突變體則完全失活。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，上述突變體均可以被PAM所激活。這些結(jié)果證明了CRD參與了VFT-HD之間的偶聯(lián)。利用其他手段我們證實(shí)了mGluR2-C500A具有完整的活性，并且其組成性活性依賴(lài)于CRD間的二硫鍵的存在

7、，由此推測(cè)，其組成性活性可能與VFT和CRD之間的相對(duì)位置發(fā)生改變有關(guān)。為了證實(shí)這一點(diǎn)，我們進(jìn)一步在CRD中進(jìn)行了雙突變體的研究，結(jié)果功能實(shí)驗(yàn)表明，與預(yù)測(cè)的一致，mGluR2-C500AC519A恢復(fù)了配體誘導(dǎo)的激活性質(zhì)；而生物化學(xué)研究表明，VFT的C234具有與CRD中的C500、C518、C519間形成二硫鍵的潛力，從而形成不同的構(gòu)象并呈現(xiàn)不同的生理效應(yīng)。類(lèi)似的結(jié)果在mGluiR4和mGluR5中也得到了驗(yàn)證。
　　 這些結(jié)

8、果對(duì)我們解析CRD的空間結(jié)構(gòu)，以及理解CRD在二聚體激活過(guò)程中所發(fā)生的構(gòu)象變化，具有重要的意義。
　　 本文還利用生物信息學(xué)的方法研究了C族受體的進(jìn)化路徑。C族受體的VFT與一些細(xì)菌中轉(zhuǎn)運(yùn)小分子的PBPs具有共同的起源,但不同于PBPs，不同受體的VFT的配體結(jié)合具有高度的專(zhuān)一性。本文運(yùn)用一種擴(kuò)展的系統(tǒng)進(jìn)化分析法，通過(guò)比較C族受體中的五種典型成員的VFT，來(lái)研究配體結(jié)合的專(zhuān)一性，這種基因/結(jié)構(gòu)復(fù)制引起的功能上的趨異變化，是否是由