甘薯GGPPS基因的克隆分析及抗草甘膦半夏的獲得.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、萜類化合物(Terpenoids)是植物天然產(chǎn)物中最大的一類化合物,其結(jié)構(gòu)和功能高度多樣化,迄今已有30000多種植物來源的萜類化合物。植物萜類化合物具有重要的生物學(xué)功能,作為光合色素的類胡蘿卜素是自然界分布最為廣泛的一類色素,總數(shù)達(dá)600多種。不少類胡蘿卜素具有VA原和抗癌活性,因而是人和動物食物中不可缺少的成分。 香葉基香葉基焦磷酸合成酶(GGPPS)催化15碳的FPP和5碳的IPP縮合生成20碳的GGPP,GGPP作為類胡

2、蘿卜素合成的直接前體,它的合成在類胡蘿卜素的代謝中起著尤為關(guān)鍵的作用。為研究甘薯類胡蘿卜素生物合成的分子機(jī)理和為甘薯類胡蘿卜素代謝工程提供靶點(diǎn),用RACE技術(shù)從甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)新品種“渝蘇303”中克隆了GGPPS基因全長cDNA,并且對該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、組織表達(dá)譜分析和功能驗(yàn)證??寺〉母适鞧GPPS基因(GenBank(R)登錄號:EU570195;IbGGPPS)cDNA全長1368b

3、p,其長度1089bp的開放閱讀框(ORF)編碼長度為363個氨基酸殘基的GGPPS蛋白(IbGGPPS)。生物信息學(xué)分析顯示IbGGPPS及其編碼的蛋白與已知GGPPS基因和蛋白序列同源。IbGGPPS序列包含GGPPS蛋白典型的兩個富含天冬氨酸的域,這兩個富含天冬氨酸域是和GGPPS活性有重要作用的焦磷酸結(jié)合位點(diǎn)。亞細(xì)胞定位預(yù)測IbGGPPS定位于質(zhì)體。將IbGGPPS與來源于被子植物和裸子植物的GGPPSs構(gòu)建分子發(fā)育樹,結(jié)果表明

4、GGPPSs在進(jìn)化樹上分為被子植物和裸子植物兩大類,IbGGPPS隸屬被子植物的一枝。利用半定量RT-PCR技術(shù)對IbGGPPS進(jìn)行組織表達(dá)譜分析,結(jié)果表明IbGGPPS在薯塊和嫩葉中表達(dá)量最高,在成熟葉片和根中表達(dá)量次之,在莖中則檢測不到IbGGPPS的表達(dá)。用lbGGPPS的ORF序列替換pTrcAtIPI質(zhì)粒上的擬南芥IPI基因編碼區(qū),獲得pTrcIbGGPPS質(zhì)粒;在大腸桿菌XLl-Blue中同時導(dǎo)入pACCAR25ΔcrtE質(zhì)

5、粒和pTrcIbGGPPS質(zhì)粒,構(gòu)建了其β-胡蘿卜素的合成途徑。該菌在顏色互補(bǔ)平板上菌落呈現(xiàn)明亮的橘黃色。結(jié)果表明,IbGGPPS編碼的蛋白具有典型GGPPS的功能。對IbGGPPS的克隆分析和功能鑒定研究,有助于在分子遺傳學(xué)水平上了解IbGGPPS的功能,并對研究甘薯類胡蘿卜素前體合成的分子機(jī)理有一定幫助。 轉(zhuǎn)化體篩選方法的研究是植物基因工程中的一個重要課題,運(yùn)用抗草甘膦基因作為篩選標(biāo)記基因是一種廉價、安全、高效的篩選方法。草

6、甘膦是目前使用最廣泛的一種非選擇性廣譜除草劑,它是EPSPS酶的競爭性抑制劑,阻止莽草酸轉(zhuǎn)為分支酸,抑制芳香族氨基酸的合成。將草甘膦不敏感型:EPSPS酶基因?qū)胫参锖?,可使植物獲得草甘瞵抗性。同時莽草酸途徑只存在于植物和微生物,抗草甘膦基因?qū)θ梭w是非常安全的。本研究用攜帶植物表達(dá)載體pASM12的根癌農(nóng)桿菌LBA4404對半夏進(jìn)行葉盤法轉(zhuǎn)化;在選擇培養(yǎng)基中加入10mg/L的草甘膦進(jìn)行篩選,獲得草甘膦抗性的再生植株;對再生植株進(jìn)行PCR

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