胞紅蛋白在氧化低密度脂蛋白誘導內(nèi)皮細胞損傷中的作用及機制.pdf

1、目的:胞紅蛋白（cytoglobin，CYGB）是一種具有抗氧化應激作用的珠蛋白，研究顯示CYGB能夠通過抗氧化應激來達到細胞保護作用。本文旨在探討人臍靜脈內(nèi)皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs）在氧化損傷過程中CYGB的表達；構建CYGB表達/干擾質粒HUVECs模型，研究CYGB在氧化應激過程中對HUVECs的保護作用并探討可能的機制。
　　方法:
　　1、培

2、養(yǎng)HUVECs，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。
　　2、實驗分為4組：對照組，25μg/ml oxLDL、50μg/ml oxLDL、100μg/ml oxLDL、200μg/ml oxLDL處理組；Western blot檢測HUVECs在不同濃度oxLDL刺激24h后，細胞內(nèi)CYGB蛋白的表達水平；Western blot檢測HUVECs在100μg/ml oxLDL刺激不同時間（4、8、12、24h）后，細胞內(nèi)CYGB蛋白的表達

3、水平。
　　3、將HUVECs分為4組：對照組、100μg/ml oxLDL組、100μg/ml oxLDL+CYGB組及100μg/ml oxLDL+CYGB shRNA組，然后觀察在氧化應激時CYGB對HUVECs的作用。于24h后，檢測CYGB蛋白水平、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase,GSH-PX）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）、乳酸脫氫酶（Lactic

4、 Dehydrogenase,LDH）的活性以及丙二醛（Malondialdehyde,MDA）的含量，以及Bcl2和Bax的蛋白水平；
　　4、將HUVECs分為3組：對照組、100μg/ml oxLDL組、100μg/ml oxLDL+Staurosporine（PKC抑制劑）組。觀察PKC抑制劑在oxLDL誘導HUVECs損傷中的作用。檢測CYGB蛋白水平、GSH-PX、SOD、LDH、MDA、Bcl2和Bax的蛋白水平。<

5、br>　　結果:
　　1、倒置顯微鏡下顯示，正常HUVECs呈現(xiàn)典型鋪路石狀態(tài)。
　　2、Western blot結果顯示：0，25μg/ml oxLDL、50μg/ml oxLDL、100μg/ml oxLDL處理HUVECs24h后，CYGB表達水平高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；100μg/ml oxLDL處理 HUVECs4、8、12、24h后，CYGB表達水平高于對照組，在24h組CYGB表達水平最

6、高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　3、轉染CYGB表達質粒后HUVECs中CYGB的表達明顯增加；轉染CYGB干擾質粒后HUVECs中CYGB的表達明顯降低。
　　4、Western blot結果顯示：100μg/ml oxLDL組和100μg/ml oxLDL+CYGB組中CYGB蛋白表達水平均高于正常對照組，而100μg/ml oxLDL+CYGB shRNA組中CYGB蛋白表達水平則低于正常對照組，差異有統(tǒng)計

7、學意義（P<0.05）。與100μg/ml oxLDL組相比，100μg/ml oxLDL+CYGB組中細胞SOD、GSH-PX活性顯著提高，Bcl2的表達也顯著增加（P<0.05），LDH的活性和MDA的含量明顯降低，Bax的表達明顯降低（P<0.05）；與100μg/ml oxLDL組相比，100μg/ml oxLDL+CYGB shRNA組中細胞SOD、GSH-PX活性顯著降低，Bcl2的表達降低（P<0.05），LDH的活性和M

8、DA的含量明顯升高，Bax的表達增加（P<0.05）。
　　5、Western blot結果顯示：與正常對照組相比，100μg/ml oxLDL組CYGB表達升高；而與100μg/ml oxLDL組相比，100μg/ml oxLDL+Staurosporine組中CYGB蛋白表達水平降低（P<0.05）；與100μg/ml oxLDL組相比，100μg/ml oxLDL+Staurosporine組中細胞SOD、GSH-PX明顯降