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文檔簡介
1、目的:胞紅蛋白(cytoglobin,CYGB)是一種具有抗氧化應激作用的珠蛋白,研究顯示CYGB能夠通過抗氧化應激來達到細胞保護作用。本文旨在探討人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)在氧化損傷過程中CYGB的表達;構建CYGB表達/干擾質粒HUVECs模型,研究CYGB在氧化應激過程中對HUVECs的保護作用并探討可能的機制。
方法:
1、培
2、養(yǎng)HUVECs,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。
2、實驗分為4組:對照組,25μg/ml oxLDL、50μg/ml oxLDL、100μg/ml oxLDL、200μg/ml oxLDL處理組;Western blot檢測HUVECs在不同濃度oxLDL刺激24h后,細胞內(nèi)CYGB蛋白的表達水平;Western blot檢測HUVECs在100μg/ml oxLDL刺激不同時間(4、8、12、24h)后,細胞內(nèi)CYGB蛋白的表達
3、水平。
3、將HUVECs分為4組:對照組、100μg/ml oxLDL組、100μg/ml oxLDL+CYGB組及100μg/ml oxLDL+CYGB shRNA組,然后觀察在氧化應激時CYGB對HUVECs的作用。于24h后,檢測CYGB蛋白水平、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-PX)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、乳酸脫氫酶(Lactic
4、 Dehydrogenase,LDH)的活性以及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量,以及Bcl2和Bax的蛋白水平;
4、將HUVECs分為3組:對照組、100μg/ml oxLDL組、100μg/ml oxLDL+Staurosporine(PKC抑制劑)組。觀察PKC抑制劑在oxLDL誘導HUVECs損傷中的作用。檢測CYGB蛋白水平、GSH-PX、SOD、LDH、MDA、Bcl2和Bax的蛋白水平。<
5、br> 結果:
1、倒置顯微鏡下顯示,正常HUVECs呈現(xiàn)典型鋪路石狀態(tài)。
2、Western blot結果顯示:0,25μg/ml oxLDL、50μg/ml oxLDL、100μg/ml oxLDL處理HUVECs24h后,CYGB表達水平高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);100μg/ml oxLDL處理 HUVECs4、8、12、24h后,CYGB表達水平高于對照組,在24h組CYGB表達水平最
6、高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
3、轉染CYGB表達質粒后HUVECs中CYGB的表達明顯增加;轉染CYGB干擾質粒后HUVECs中CYGB的表達明顯降低。
4、Western blot結果顯示:100μg/ml oxLDL組和100μg/ml oxLDL+CYGB組中CYGB蛋白表達水平均高于正常對照組,而100μg/ml oxLDL+CYGB shRNA組中CYGB蛋白表達水平則低于正常對照組,差異有統(tǒng)計
7、學意義(P<0.05)。與100μg/ml oxLDL組相比,100μg/ml oxLDL+CYGB組中細胞SOD、GSH-PX活性顯著提高,Bcl2的表達也顯著增加(P<0.05),LDH的活性和MDA的含量明顯降低,Bax的表達明顯降低(P<0.05);與100μg/ml oxLDL組相比,100μg/ml oxLDL+CYGB shRNA組中細胞SOD、GSH-PX活性顯著降低,Bcl2的表達降低(P<0.05),LDH的活性和M
8、DA的含量明顯升高,Bax的表達增加(P<0.05)。
5、Western blot結果顯示:與正常對照組相比,100μg/ml oxLDL組CYGB表達升高;而與100μg/ml oxLDL組相比,100μg/ml oxLDL+Staurosporine組中CYGB蛋白表達水平降低(P<0.05);與100μg/ml oxLDL組相比,100μg/ml oxLDL+Staurosporine組中細胞SOD、GSH-PX明顯降
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