羊無(wú)漿體間接ELISA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、羊無(wú)漿體(Anaplasma ovis)是一種由媒介蜱傳播的專(zhuān)性紅細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌，主要引起綿羊和山羊的無(wú)漿體病。羊無(wú)漿體病臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、貧血、黃疸和消瘦，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡。羊無(wú)漿體病在全世界呈廣泛流行，阻礙了養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展，給養(yǎng)羊業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，針對(duì)該病的檢測(cè)技術(shù)主要有血涂片顯微鏡鏡檢和PCR，但是相對(duì)于基層單位，顯微鏡鏡檢專(zhuān)業(yè)性太強(qiáng)，PCR儀器較為昂貴，且由于基層的科研條件有限，所以在實(shí)際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用

2、較困難。本研究以羊無(wú)漿體為研究對(duì)象，通過(guò)質(zhì)譜和生物信息學(xué)分析技術(shù)，鑒定出羊無(wú)漿體特異性的Anaplasma ovis Appendage-Associated Protein(AAAP)，針對(duì)該蛋白，建立了檢測(cè)羊無(wú)漿體特異性抗體的間接ELISA檢測(cè)技術(shù)。應(yīng)用本研究建立的方法，對(duì)采自我國(guó)23個(gè)省份54個(gè)不同地區(qū)的3138份血清進(jìn)行羊無(wú)漿體病的血清學(xué)流行病學(xué)調(diào)查。
　　1.利用免疫沉淀技術(shù)分析找出羊無(wú)漿體感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物前后抗體變化的差異

3、蛋白條帶，通過(guò)質(zhì)譜鑒定，與基因組數(shù)據(jù)比對(duì)，BLAST比對(duì)分析，篩選出相似度低于45％的特異性的羊無(wú)漿AAAP蛋白。
　　2.利用原核表達(dá)載體對(duì)羊無(wú)漿體AAAP基因進(jìn)行截短表達(dá)，純化，經(jīng)Western-blot分析表明重組蛋白與羊無(wú)漿體陽(yáng)性血清具有較好的反應(yīng)性，與綿羊肺炎支原體、山羊支原體山羊亞種、莫氏巴貝斯蟲(chóng)臨潭株、巴貝斯蟲(chóng)未定種新疆株、尤氏泰勒蟲(chóng)、呂氏泰勒蟲(chóng)的陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)，表明該蛋白適合用作羊無(wú)漿體病的診斷抗原。
　

4、　3.以重組的羊無(wú)漿體AAAP蛋白為抗原，建立了用于羊無(wú)漿體病抗體檢測(cè)的間接ELISA方法。通過(guò)對(duì)597份參考血清（434份陰性血清和163份陽(yáng)性血清）檢測(cè)，經(jīng)MedCalc軟件分析，當(dāng)確定ELISA方法的閾值為6.00％時(shí)，其特異性為94.5％，敏感性為91.4％。
　　4.應(yīng)用本研究建立的間接ELISA方法對(duì)我國(guó)23省份54個(gè)不同地區(qū)的3138份血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示羊無(wú)漿體病在我國(guó)23個(gè)省份均有流行，不同省份羊無(wú)漿體的抗體陽(yáng)