蜱傳腦炎病毒中和抗體研究.pdf

1、蜱傳腦炎（tick-borne encephalitis，TBE）又名森林腦炎，是經(jīng)硬蜱媒介傳播的自然疫源性傳染病，主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，病原體是蜱傳腦炎病毒（tick-borne encephalitis virus,TBEV）。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球每年有超過10000例蜱傳腦炎感染患者；在我國，蜱傳腦炎已被列為5大職業(yè)性傳染病之一。近年來隨著國家經(jīng)濟高速發(fā)展、旅游業(yè)爆發(fā)式增長，遠足、探險等戶外活動興起，進入森林疫區(qū)人群數(shù)量呈現(xiàn)逐

2、年上升趨勢，蜱傳腦炎的發(fā)病率也在逐年升高，威脅著廣大人民群眾的生命健康。此外，蜱傳腦炎病毒還是重要的生物戰(zhàn)劑之一，美國CDC將其列為病毒C類生物武器。蜱傳腦炎致殘率高，臨床上尚無特異性療法，主要采用支持治療和一般對癥治療為主。疫苗接種是預(yù)防蜱傳腦炎的主要手段之一。
　　當前，大部分蜱傳腦炎病毒抗體多是研究用的鼠源性單抗，尚未有全人源TBEV單抗報道。在本研究中，我們擬通過流式分選-單細胞PCR技術(shù)，從蜱傳腦炎疫苗免疫志愿者體內(nèi)篩選

3、獲得全人源中和單克隆抗體，為蜱傳腦炎治療和預(yù)防提供新的途徑。
　　實驗選取2名健康男性志愿者（25-40歲），在告知并簽署知情同意書后按照蜱傳腦炎滅活疫苗（長春生物制品研究所有限公司研制）說明書要求，分別在第0天、14天對志愿者進行2次免疫，又在第42天加強免疫1次。采集志愿者第0天、21天、28天、49天和63天血液樣本，ELISA檢測血清抗體滴度，結(jié)果表明兩名志愿者均產(chǎn)生了針對TBEV的特異抗體。用Ficoll-hypaque

4、法分離志愿者第49天血液樣本20 mL，獲得的外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）經(jīng)熒光抗體標記后，用流式細胞分選儀分選出CD19+/CD3-/CD20-/CD27high/CD38high特異的單個抗體分泌細胞。
　　我們先后共計分選獲得1632個單細胞克隆，占上樣細胞總數(shù)的0.02％；經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和巢式PCR擴增抗體可變區(qū)基因，擴增出重、輕鏈配對克隆349個，配對克隆的

5、擴增效率約21.38%；對巢式PCR產(chǎn)物進行測序和IMGT/V-QUEST分析，最終獲得有用克隆175個。對175個單克隆巢式PCR產(chǎn)物進一步擴增抗體基因可變（V）區(qū)，通過重疊延伸PCR技術(shù)與抗體啟動子-前導序列和恒定區(qū)-多聚A尾序列連接，構(gòu)建出抗體基因重、輕鏈線性表達框。將抗體線性表達框基因轉(zhuǎn)染到Expi293F細胞進行表達后，ELISA方法篩選到14株具有結(jié)合活性的單克隆抗體。我們進一步驗證了這14株結(jié)合單抗在BHK-21細胞中對T

6、BEV活病毒的中和效果，發(fā)現(xiàn)兩株具有一定中和保護能力的單抗1C4和3E12。在抗體濃度達到200μg/mL以上時，1C4和3E12兩株單抗對細胞能夠起到完全保護效果，其中1C4的保護效果要強于3E12，1C4的IC50值為75μg/mL，而3E12的IC50值為108μg/mL。
　　為對篩選到的抗體作進一步研究，我們在原核系統(tǒng)表達純化了TBEV抗原E和NS1蛋白。TBEV在病毒分類學上屬黃病毒科（Flavivirade）黃病毒屬

7、（Flavivirus），為單股正鏈RNA包膜病毒。其抗原成分包括結(jié)構(gòu)蛋白E和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1。我們將TBEV抗原E和NS1基因克隆到pET-32a表達載體上，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞進行誘導表達和純化，兩個蛋白均以包涵體形式表達。NS1蛋白純化過程以尿素為變性劑，將包涵體溶解后過鎳柱純化，然后通過逐步減少尿素濃度進行透析復性，最后獲得純化的NS1蛋白；E蛋白用相同方法進行純化時，在復性過程中總是會變成沉淀析出，于是我們嘗試采用比較溫和的

8、變性劑—十二烷基肌氨酸鈉溶解包涵體，然后在含氧化還原體系（GSH和GSSG）的TE緩沖液中進行透析復性，最后獲得E抗原蛋白。
　　我們將純化好的NS1蛋白和E蛋白與志愿者陽性血清分別進行Western Blot和ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)陽性血清只與E蛋白反應(yīng)而不與NS1蛋白起作用，說明本研究中使用的滅活疫苗有效成分包含抗原E蛋白，而不包含NS1蛋白。將E抗原蛋白包被后與中和單抗1C4、3E12進行ELISA驗證，結(jié)果表明具有中和活性的

9、1C4和3E12兩株單抗與原核表達的E抗原蛋白具有較弱的結(jié)合活性，這可能是因為兩株單抗本身親和力較低。
　　考慮到原核表達的抗原蛋白缺乏糖基化修飾；此外，蜱傳腦炎病毒膜蛋白prM在病毒復制成熟過程中也起重要作用，所以我們又分別將抗原prM-E和NS1基因克隆到真核表達載體pDC316，并在293T細胞中進行了表達。用志愿者陽性血清對293T細胞裂解物進行Western Blot鑒定，可觀察到prM-E蛋白在55 kDa處出現(xiàn)特異性

10、條帶，說明prM-E基因得到表達并能與陽性血清反應(yīng)；而NS1蛋白無目的條帶，考慮是因為NS1蛋白不是滅活疫苗的有效抗原成分，志愿者血清中缺乏抗NS1抗體所致。在Western Blot實驗中，我們發(fā)現(xiàn)prM-E抗原在真核表達的細胞裂解物沉淀，在與篩選到的中和單抗單獨反應(yīng)時均難以出現(xiàn)明顯目的條帶；而將兩株單抗混合在一起時，則可以看到明顯特異條帶。這說明我們篩到的兩株中和單抗可能分別結(jié)合于抗原E蛋白的不同表位，盡管單獨使用時抗原抗體相互作用

11、比較弱，但混合在一起仍可看出明顯特異條帶。
　　綜上所述，本研究基于流式分選-單細胞PCR技術(shù)成功從蜱傳腦炎滅活疫苗免疫志愿者體內(nèi)篩選獲得2株具有中和活性的單克隆抗體，該抗體可進一步研究用作潛在的治療蜱傳腦炎感染的被動免疫制劑；通過原核和真核表達系統(tǒng)表達了TBEV抗原蛋白E和NS1，其中只有E抗原能與志愿者陽性血清有結(jié)合反應(yīng)，說明滅活疫苗的有效成分包含抗原E蛋白；此外，篩選到的中和單抗與抗原E蛋白具有結(jié)合活性，說明兩株中和單抗的靶