IgG4在腫瘤微環(huán)境中表達及其生物學功能研究.pdf

1、目的：
　　免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig），是人體內分泌最多、分布最廣的免疫活性分子。Ig是由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的“Y”字形四肽結構。按重鏈（u、γ、α、δ、ε）氨基酸的不同序列分為五大類型：IgM，IgG，IgA，IgD和 IgE。IgG（immunoglobulin G）,約占免疫球蛋白總量的75％-85%，在血液、組織液中分布廣泛，是體液免疫的重要組成部分。IgG4，是人體內含量最少的IgG亞型，在正常

2、人體內占總IgG含量不到5%。近幾年 IgG4由于 Fab段交換作用（Fab Arm Exchange，F(xiàn)AE）而備受關注，目前關于IgG4的研究主要集中在IgG4相關性疾病（IgG4-related disease，IgG4-RD）、炎癥性疾病和自身免疫性疾病，極少涉及到惡性腫瘤。我們的實驗發(fā)現(xiàn) IgG4在食管癌組織中有顯著升高，隨后我們檢測了食管癌病人血清中IgG4的含量，也存在這一趨勢。為了探究腫瘤組織中以及血液循環(huán)中這種升高的趨

3、勢與臨床病理分期是否相關，腫瘤病人體內的IgG4與正常人體內的 IgG4含量的差異是否有意義，IgG4在腫瘤免疫微環(huán)境中究竟扮演什么樣角色。我們利用現(xiàn)有的資料和資源展開了一系列的實驗。
　　方法：
　　75例腫瘤相關組織樣本來自于汕頭大學附屬腫瘤醫(yī)院病理科和汕頭大學粵東地區(qū)病理會診中心，59例食管癌病人血液樣本來自于汕頭大學附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科，26例健康人血液樣本來自于汕頭大學志愿者,實驗樣本的收集和使用均已通過汕頭大學醫(yī)學

4、院醫(yī)學倫理委員會的審核、批準。免疫組化和染色-脫色-再染色（stain destain restain，SDS）技術：利用SDS技術在同一張切片上完成 IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4等4種抗原在食管癌腫瘤組織上表達的檢測，經過軟件處理后得到整合的圖像。免疫熒光雙重染色：在同一張組織切片上孵育兩種不同來源的抗體，在食管癌組織上檢測兩種不同的抗原，用紅綠兩種熒光顯示所檢測的抗原，藍色顯示細胞核。IgG的提?。喝〗】等思澳[瘤病人血漿

5、，利用rProteinG親和層析柱分離得到IgG。羅氏免疫比濁法檢測血清中IgG4及全IgG的含量：檢測收集的59例食管癌病人（病例組）和26例正常人（對照組）血清 IgG及 IgG4，計算 IgG4占總 IgG的比例，統(tǒng)計分析兩組間差異。木瓜蛋白酶酶切：IgG在半胱氨酸存在的條件下，木瓜蛋白酶在 IgG鉸鏈區(qū)以上的位置進行切割，干燥箱37℃震蕩5小時，經過Protein A純化，分離得到純Fab，F(xiàn)c段，離心濃縮測濃度，備用。蛋白質B

6、iotin標記法：將蛋白與活化液混合，加入DEMO和Biotin，室溫震蕩40分鐘。充分反應后用除鹽柱將標記好Biotin的蛋白質純化，放4℃冰箱儲存，備用。將蛋白酶切得到的產物，經過SDS-PAGE電泳，硝酸銀染色，鑒定 IgG、IgG亞型以及酶切后得到的各類IgG組分。蛋白質免疫印跡：將標記上 Biotin的 IgG4作為一抗，和轉移在硝酸纖維素膜上的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及IgG1的Fab、Fc孵育，檢測蛋白之間的

7、反應。
　　結果：
　　在免疫組化中，食管癌病人腫瘤組織中 IgG4陽性漿細胞數(shù)，比癌旁組織、正常組織多，并且IgG4的水平升高與病人的臨床病理分期有相關關系。免疫熒光雙重染色中，IgG4和 IgG1、IgG2、IgG3陽性細胞不重疊，并且 IgG4陽性細胞比例較高。SDS中， IgG4、IgG1、IgG2、IgG3在同一組織切片上染色，高倍鏡下同一視野內， IgG4/IgGtotal相對比例較高。IgG4含量和IgG4的相

8、對水平（IgG4/IgGtotal）在食管癌病人血清中比正常人高，且具有統(tǒng)計學意義(IgG4：P<0.0001；IgG4/IgG：P=0.003）。western blot中 Biotin標記的 IgG4和 IgG四種亞型在50KD位置附近有反應條帶；Biotin標記的 IgG4 Fab片段和 IgG1的 Fab片段沒有反應條帶，而與 IgG1的 Fc片段在30KD位置附近有反應條帶。另外，IgG4的重鏈在50KD的附近位置有兩條不同大

9、小的條帶，并且IgG4的Fab片段在25KD的附近位置也有兩條大小不同的條帶。
　　結論：
　　在食管癌病人體內IgG4含量及 IgG4/IgGtotal水平升高，并且 IgG4的升高與腫瘤病人的臨床病理分期有相關關系，說明 IgG4在免疫系統(tǒng)可能是免疫負調控的終產物，機體面對長期存在的抗原無法有效清除而產生的一種妥協(xié)狀態(tài)。通過免疫組化、免疫熒光雙重染色、木瓜蛋白酶酶切、western blotting、ADCC等實驗證明，

10、IgG4由漿細胞產生，四種IgG亞型由不同的漿細胞分泌，四種亞型之間不交叉， IgG4能夠和 IgG各亞型反應， IgG4通過Fab段能夠和IgG1的Fc段發(fā)生反應。據(jù)此，推測IgG4作為blocking antibody通過與腫瘤殺傷性性抗體 IgG1的 Fc段結合，從而干擾 IgG1與補體、FcR結合，下調IgG1介導的ADCC、ADCP作用。IgG4下調細胞免疫反應的作用這一機制為腫瘤的體液免疫也提供新的認識，也為腫瘤的治療提供新