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文檔簡介
1、卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)生率僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌,居第三位,然而其致死率高居首位。卵巢癌起病隱匿,大多數(shù)患者診斷時已為晚期。在過去的幾十年中,對卵巢癌患者的基本治療方案采取理想的腫瘤細胞減滅術(shù)輔助鉑類藥物為主的聯(lián)合化療,雖然取得了一定的療效,但是仍有70%左右的患者在18個月內(nèi)復發(fā),晚期卵巢癌患者的5年生存率僅為30%。目前認為腫瘤的耐藥及復發(fā)是造成卵巢癌高死亡率的主要原因,但是卵巢癌耐藥及復發(fā)的機制目前仍不清楚,故而嚴
2、重阻礙了卵巢癌的有效治療。
自上世紀來,腫瘤干細胞(Cancer stem cells,CSCs)理論被提出,認為腫瘤組織中存在少量的干細胞,是導致腫瘤進展、復發(fā)及化療耐藥的根源。Bonnet和Dick從白血病患者中分離出CD34+CD38-細胞被證實具有干細胞特性,這是世界上首次發(fā)現(xiàn)CSCs的存在。之后大量研究相繼發(fā)現(xiàn)多種實體腫瘤中也存在極少量的CSCs,如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等。研究表明,CSCs具有分化、自我更新等類
3、似正常干細胞的生物學特性,同時具有致瘤能力且對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。目前腫瘤干細胞的研究取得了很大的進展,在一些實體腫瘤中已建立了一系列CSCs分離、鑒定的方法,對腫瘤發(fā)生、進展、耐藥和復發(fā)的機制的研究以及探索腫瘤治療的新領域具有重要意義。
近年來,CSCs理論被應用于卵巢癌的研究中取得了一定的成績。但是,目前對于卵巢癌干細胞的研究仍在借鑒其他實體腫瘤的方法,如對卵巢癌干細胞的識別缺乏較為特異的標記物,目前使用較多的標記物有CD
4、133、CD117、CD44、ALDH1、EPCAM等,其中CD44被作為乳腺癌、胰腺癌等CSCs的標記物,CD133被作為結(jié)腸癌等CSCs的標記物等。其分離獲得的方法仍主要依靠SP細胞的分選。因此,尋找特異性的表面標記物,對于卵巢癌干細胞的研究極其重要,對探索卵巢癌新的治療方法具有重大意義。
本課題前期工作中利用穩(wěn)定同位素標記及質(zhì)譜為基礎的蛋白質(zhì)組學技術(shù)分析比較卵巢癌細胞系SP和非SP細胞膜蛋白的差異表達,篩選出一種跨膜蛋白
5、30A(transmembrane protein30A,TMEM30A),又稱細胞周期蛋白50A(cell division cycle50A,CDC50A),并通過大量體內(nèi)外實驗對卵巢癌細胞系及原代卵巢癌細胞CDC50A+細胞進行鑒定,證實其具有CSCs生物學特性,是CDC50A有望成為卵巢癌干細胞較為特異的表面標記物。
目的:
本研究承接前期工作,對CDC50A參與維持卵巢癌干細胞特性及其相關作用機制做進一步研
6、究。
方法:
1.構(gòu)建CDC50A+細胞比例下調(diào)的SKOV3細胞。用4段CDC50A shRNA轉(zhuǎn)染293T細胞,運用Western blot方法篩選能有效下調(diào)CDC50A基因表達的shRNA,包裝慢病毒載體,并利用通過慢病毒感染技術(shù),下調(diào)卵巢癌細胞系SKOV3中CDC50A+細胞比例,利用流式細胞學方法檢測其下調(diào)效率。利用流式分選儀分選得到CDC50A+細胞比例下調(diào)組(SKOV3 CDC50A-GFP)細胞和陰性對
7、照組(SKOV3NC-GFP)細胞。采用流式細胞學方法檢測SKOV3 CDC50A-GFP及SKOV3 NC-GFP中CDC50A的表達水平。
2.CDC50A+細胞比例下調(diào)的SKOV3細胞干細胞特性的鑒定。利用含血清的HG-DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng),驗證SKOV3 CDC50A-GFP及SKOV3 NC-GFP細胞的分化能力。利用無血清懸浮培養(yǎng)方法,檢測SKOV3 CDC50A-GFP及SKOV3 NC-GFP細胞sphere
8、形成能力及傳代能力,并運用流式細胞學方法驗證sphere對CDC50A的富集作用。MTT法檢測SKOV3 CDC50A-GFP和NC-GFP細胞對順鉑的耐藥性。將SKOV3 CDC50A-GFP和NC-GFP細胞等量接種于NSG小鼠皮下,觀察成瘤情況,檢測其成瘤能力。
3.人卵巢癌CDC50A+和CDC50A-細胞RNA測序及其與干細胞功能相關的機制分析。收集3例卵巢癌患者腫瘤組織,分離得到卵巢癌細胞,利用流式細胞分選儀分選獲
9、得CDC50A+和CDC50A-細胞,分別提取兩組細胞RNA,進行RNA測序。獲得兩組細胞的差異表達基因,并對其進行功能分析和相關信號通路的富集分析。
結(jié)果:
1.成功構(gòu)建CDC50A+細胞比例下調(diào)的SKOV3細胞。Western方法檢測轉(zhuǎn)染4段CDC50A shRNA的293T細胞的CDC50A表達,序列TMEM30A-homo-974沉默CDC50A基因的效率最高,其靶序列為GCCTGTGAACTGGCTTAAA
10、CC。將其包裝慢病毒載體后,感染293T細胞,Western法檢測其能使CDC50A表達降低80%以上。利用慢病毒感染SKOV3細胞,流式檢測其感染效率CDC50A-GFP組為87.9%,NC-GFP組為81.6%。分選出成功感染慢病毒的兩組細胞后,流式分析SKOV3 NC-GFP細胞中CDC50A細胞比例為0.48%,而SKOV3 CDC50A-GFP細胞中CDC50A+細胞僅占0.12%。表明慢病毒感染能有效的下調(diào)卵巢癌細胞系SKO
11、V3中CDC50A+細胞比例,而含陰性對照序列的慢病毒感染對SKOV3細胞中CDC50A基因的表達基本無影響。
2.CDC50A+細胞比例下調(diào)的SKOV3細胞株干細胞的生物學特性減弱。在無血清懸浮培養(yǎng)條件下,NC-GFP細胞能形成sphere,且絕大多數(shù)能帶有綠色熒光;而CDC50A-GFP細胞sphere形成慢,且在熒光顯微鏡下僅能看到極少帶綠色熒光的sphere。SKOV3 CDC50A-GFP細胞形成的sphere個數(shù)明
12、顯少于SKOV3 NC-GFP細胞,幾乎不能傳代;而SKOV3 NC-GFP細胞形成的sphere能連續(xù)傳代至少三代。表明CDC50A基因被沉默的卵巢癌細胞系SKOV3細胞在體外sphere形成能力減弱且喪失自我更新及分化能力。流式檢測SKOV3 CDC50A-GFP和NC-GFP細胞所形成的sphere中CDC50A+細胞的比例分別為19.7%和6.7%,均比貼壁生長的細胞中的CDC50A+細胞的比例明顯升高,但SKOV3 CDC50
13、A-GFP細胞中CDC50A+比例明顯低于NC-GFP細胞。表明sphere對CDC50A+細胞具有富集作用。MTT法測定順鉑對SKOV3 CDC50A-GFP和NC-GFP細胞的IC50均值為1.33±0.14ug/ml,3.05±0.39 ug/ml,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.01)。說明CCDC50A+細胞比例下調(diào)的的卵巢癌細胞系SKOV3細胞對順鉑的耐藥性減弱。動物實驗顯示103 NC-GFP細胞能使小鼠成瘤,而同樣數(shù)量的CD
14、C50A-GFP細胞未能使小鼠成瘤。表明CDC50A基因被沉默的卵巢癌細胞系SKOV3細胞致瘤能力降低。
3.通過對CDC50A+細胞與CDC50A-細胞的RNA測序,發(fā)現(xiàn)了一些CDC50A參與維持卵巢癌干細胞特性的相關機制。對3原代卵巢癌組織中分選出的CDC50A+細胞和CDC50A-細胞進行RNA測序,分別篩選出92、59和251個差異表達基因(P<0.01)。應用RNA譜分析、生物信息學技術(shù)對差異基因及其轉(zhuǎn)錄本其進行分析
15、分析發(fā)現(xiàn)CDC50A可能通過ATPase H+ transporting V1 subunit F、MALAT1、MAPK信號及調(diào)控核糖體、剪接體功能維持卵巢癌干細胞的特性及功能。
結(jié)論:
1.利用CDC50A shRNA慢病毒載體感染技術(shù)能有效的下調(diào)卵巢癌細胞系SKOV3中CDC50A+細胞比例。
2.CDC50A+細胞比例下調(diào)的卵巢癌細胞系SKOV3干細胞生物學特性減弱,sphere形成能力、自我更新和
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