VEGF-C和Survivin在胃癌中的表達及其在淋巴結轉移中的作用研究.pdf

1、目的:
　　胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，我國胃癌的發(fā)病率高居世界首位。目前我國早期胃癌診斷率極低，局部進展與復發(fā)轉移性胃癌約占60～80％，是當前治療的重點與難點。淋巴結轉移是胃癌轉移的一個早期事件和獨立的預后因素，因此闡明胃癌淋巴結轉移的分子機制，早期預測和診斷胃癌淋巴結轉移，尋找新的分子治療靶點進行有效干預與阻斷治療，對提高胃癌患者的5年生存率具有重要意義。生理情況下，胃黏膜上皮細胞增殖和凋亡間保持動態(tài)平衡，維持其正常

2、的結構和功能。這種平衡有賴于癌基因、抑癌基因，以及某些調節(jié)肽等的調控，一旦癌基因被激活而抑癌基因被抑制，促使增殖加快，DNA損傷得不到修復，而凋亡機制不能相應啟動，使細胞獲永生，細胞周期調控機制破壞進而最終進展到癌。因此，深入研究細胞周期的信號調控機制具有重要意義。
　　Survivin基因是凋亡抑制蛋白(IAP)家族新成員，能抑制細胞凋亡、促進細胞增殖，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。同時，Survivin也是與淋巴轉移有關的凋亡調

3、節(jié)因子。已有研究表明，Survivin的表達與胃癌等多種惡性腫瘤的淋巴結轉移密切相關。Survivin的另一作用是能夠促進腫瘤新生血管的生成。實驗顯示靶向抑制survivin的表達后，可以通過促進腫瘤細胞凋亡和阻止新生血管生成來抑制腫瘤的生長。Survivin的這個作用被發(fā)現與血管內皮細胞生長因子家族中的VEGF-C有密切關系。
　　VEGF-C屬血管內皮生長因子家族成員，是胚胎組織和成熟個體淋巴管生成的唯一調節(jié)因子，其通過與淋巴

4、內皮細胞上的同族受體酪氨酸激酶VEGFR-3特異性結合，通過一系列信號傳導，激活Ras-MAPK途徑，介導淋巴管內皮細胞分裂、增殖，誘導腫瘤內部及周圍新生淋巴管形成，促進淋巴內皮細胞的遷移，同時還可以使已形成的淋巴管擴張，從而有利于惡性腫瘤的轉移和擴散。目前，在胃癌，結直腸癌，乳腺癌等多種腫瘤中發(fā)現VEGF-C的表達與淋巴管的生成、淋巴結轉移甚至患者的預后呈正相關。
　　綜上所述，Survivin和VEGF-C都具有促進胃癌淋巴結

5、轉移的作用，但是兩者之間是否存在聯系尚缺乏實驗驗證。本文擬通過研究Survivin與VEGF-C在胃癌組織及胃癌細胞中表達的相互關系，從而深入探討Survivin和VEGF-C在胃癌淋巴結轉移中的重要作用，為胃癌患者的淋巴轉移情況預測和病情評估找到合適的指標，并為治療胃癌淋巴轉移提供準確的靶向目標。
　　材料和方法:
　　1、利用胃癌組織芯片分析了195例胃癌組織標本中Survivin和VEGF-C的表達情況，以及它們與患者

6、的臨床病理特征之間的關系，并進行預后分析。觀察Survivin和VEGF-C表達的相關性。
　　2、構建攜帶針對Survivin和VEGF-C的shRNA質粒載體。通過脂質體法將質粒轉染到SGC-7901胃癌細胞中。
　　3、設計空白對照組，陰性質粒對照組，Survivin-shRNA質粒組，VEGF-C-shRNA質粒組。通過Western blot實驗檢測Survivin和VEGF-C在不同組別中的蛋白水平的表達。通過r

7、eal-time PCR檢測Survivin和VEGF-C在不同組別中的mRNA水平的表達。
　　4、應用MTT實驗、劃痕法細胞遷移實驗和Transwell法基質膠細胞侵襲實驗，觀察經轉染pGPU6-GFP-Survivin重組質粒的人胃癌細胞SGC-7901增殖、遷移以及侵襲能力的改變。
　　結果:
　　1、免疫組化結果顯示，Survivin及VEGF-C在胃癌組織中的表達率分別為51.3％和55.4％，主要在胃癌細

8、胞胞漿中表達。在淋巴結轉移的胃癌患者中，Survivin和 VEGF-C的表達明顯高于非轉移患者（P值分別為0.008和0.001）。Survivin與VEGF-C的表達均與胃癌淋巴結轉移相關，且與預后呈負相關。另外，Survivin與VEGF-C共同高表達的患者預后更差。
　　2、Western blot檢測結果顯示:Survivin蛋白的表達不受VEGF-C的調控，而VEGF-C的蛋白表達則受到Survivin表達的影響，且呈

9、正相關。Real-time PCR檢測結果顯示:在mRNA水平，Suvivin的表達不受VEGF-C的表達調控，而VEGF-C的表達則受到Survivin表達的影響，且呈正相關。該結果與Western blot基本一致。
　　3、MTT檢測結果顯示pGPU6-GFP-Survivin-shRNA重組質粒對SGC-7901細胞的增殖具有明顯的抑制效應，細胞貼壁后24h開始細胞增殖受到抑制，36h時細胞抑制極為明顯(p＜0.01)。劃

10、痕法細胞遷移實驗檢測轉染pGPU6-GFP-Survivin-shRNA重組質粒的人胃癌細胞SGC-7901，Survivin沉默組遷移能力明顯減弱。Transwell基質膠細胞侵襲實驗研究轉染pGPU6-GFP-Survivin-shRNA重組質粒的人胃癌細胞SGC-7901，發(fā)現其侵襲能力比未轉染細胞明顯減弱。
　　結論:
　　1、在胃癌組織中，Survivin與VEGF-C表達呈正相關，且與淋巴結轉移關系密切。Surv

11、ivin和VEGF-C高表達預示著預后不良。
　　2、在胃癌的淋巴轉移過程中，Survivin參與調節(jié)VEGF-C的表達，而Survivin的表達卻不受VEGF-C表達的影響。
　　3、構建的Survivin-shRNA真核表達載體能夠特異、高效的抑制胃癌細胞Survivin基因和蛋白的表達，并可抑制胃癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力。
　　4、Survivin和VEGF-C可能為治療胃癌淋巴轉移以及遠處轉移提供準確的靶向