CD82胞外結構域模擬肽段對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的影響及作用機制研究.pdf

1、CD82是抑癌基因KAI1編碼的細胞膜糖蛋白,屬于四跨膜蛋白超家族(transmembrane4 superfamily or tetraspan superfamily,TM4SF)成員之一,其主要生物學功能是參與細胞的聚集、粘附、遷移等。CD82在正常機體組織廣泛表達,在腫瘤組織表達下降。大量研究結果表明,CD82可抑制多種組織來源的腫瘤細胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移,是廣譜的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子。CD82抑制腫瘤轉(zhuǎn)移機制的研究日益受到重視,但其詳細

2、分子機理仍不完全清楚。
　　CD82由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分組成,跨膜區(qū)為四個疏水的肽段,胞外區(qū)形成一個小環(huán)(small extracellular loop,SEL)和一個大環(huán)(large extracellularloop,LEL),胞內(nèi)區(qū)包括N-端、C-端和一個細胞內(nèi)環(huán)。分子結構是蛋白發(fā)揮功能的基礎,胞外區(qū)結構域是CD82直接與細胞外基質(zhì)分子及其它細胞相互識別、結合及相互作用的部位,是CD82發(fā)揮生理功能的重要結構基礎

3、。對CD82蛋白胞外區(qū)結構域功能進行研究,可闡明其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機理。目前,對CD82的胞外區(qū)功能研究較少,尤其是胞外區(qū)SEL功能尚不明確。為研究CD82胞外結構域在CD82抑制腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用,本論文采用基因重組技術和化學合成方法得到了CD82-LEL序列模擬肽和CD82-SEL序列模擬寡肽,本文分幾個方面進行了以下幾個內(nèi)容的研究：
　　一、目的：CD82胞外區(qū)序列模擬肽段對腫瘤細胞遷移的影響。CD82抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的主要

4、機理是抑制細胞的運動和遷移能力。
　　方法：采用劃痕法、Boyden小室培養(yǎng)法對CD82-LEL和CD82-SEL序列模擬肽段體外抑制腫瘤細胞遷移作用進行了觀察。
　　結果:采用基因重組技術和化學合成方法獲得了CD82-LEL序列模擬肽和CD82-SEL序列模擬寡肽。CD82-LEL序列模擬肽對SW620腫瘤細胞的體外遷移和侵襲無明顯抑制作用,而CD82-SEL序列模擬寡肽對SW620腫瘤細胞的體外遷移和侵襲有抑制作用,處理

5、濃度越大抑制作用越強。
　　結論:CD82-LEL序列模擬肽在體外不能抑制細胞的運動和遷移,而CD82-SEL序列模擬寡肽抑制體外培養(yǎng)的細胞的運動和遷移,隨處理濃度增大抑制作用增強。說明,CD82-SEL可能是CD82抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的重要功能結構域。
　　二、目的：CD82胞外區(qū)序列模擬肽段對腫瘤細胞與不同細胞外基質(zhì)分子識別、粘附的影響。CD82胞外結構域直接參與細胞與細胞外基質(zhì)間的識別、結合,因此,是CD82參與細胞遷移、運

6、動的重要結構,也是其腫瘤轉(zhuǎn)移抑制作用的重要功能部位。
　　方法：觀察了CD82-LEL序列模擬肽和CD82-SEL序列模擬寡肽對SW620腫瘤細胞與層粘連蛋白(Laminin,LN)、纖粘連蛋白(Fibronectin,FN)、基質(zhì)膠(Matrigel)粘附的影響。
　　結果:CD82-LEL序列模擬肽對SW620腫瘤細胞與LN、FN、Matrigel的粘附無明顯抑制作用,而CD82-SEL序列模擬寡肽對SW620腫瘤細胞與

7、LN、FN、Matrigel的粘附有明顯抑制作用,且其抑制能力與處理濃度呈正相關。
　　結論:CD82-LEL序列模擬肽不能獨自參與腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)的識別、粘附,或由失去糖鏈結構而致;CD82-SEL序列模擬寡肽具有抑制腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)的識別、粘附作用,這可能與CD82-SEL序列模擬寡肽抑制腫瘤細胞的遷移運動有關。
　　三、目的：CD82-SEL序列模擬寡肽影響整合素與細胞外基質(zhì)分子之間的相互作用。分布于細胞表面的

8、粘附分子中,只有整合素的配體是細胞外基質(zhì)分子,包括FN、LN、玻璃粘連蛋白(Vitronecin,VN)和膠原蛋白(Collagen,CA)等。所以只有整合素才是介導細胞與細胞外基質(zhì)接觸結合的粘附分子。有文獻報道,CD82可抑制整合素與LN的結合,并發(fā)現(xiàn)CD82在細胞表面常與整合素、生長因子受體及其他四跨膜家族蛋白結合成復合體而發(fā)揮作用。
　　方法：為探討CD82-SEL序列模擬寡肽抑制細胞的運動和遷移以及抑制細胞與細胞外基質(zhì)粘附

9、的分子機制,我們對整合素在CD82-SEL序列模擬寡肽抑制腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)的識別、粘附過程中的作用進行了初步研究。
　　結果:(1)采用Western Blot技術檢測了不同類型整合素亞基在SW620腫瘤細胞的表達圖譜。結果顯示,SW620細胞可表達α3、α4、α5、α6、β1、β3亞基。(2)細胞外基質(zhì)分子LN刺激SW620細胞整合素α3、α6、β1亞基的表達,FN刺激SW620細胞整合素α4、α5、β1亞基的表達,Matr

10、igel刺激SW620細胞整合素α3、β1亞基的表達。(3) CD82-SEL序列模擬寡肽可分別抑制LN、FN和Matrigel刺激的SW620細胞整合素α3、α4、α5、α6、β1亞基的表達。其抑制作用隨處理濃度增加而增強。(4)整合素α3、α6、β1亞基可與LN結合,α4、α5、β1亞基可與FN結合,α3、β1亞基可與Matrigel結合。(5) CD82-SEL序列模擬寡肽抑制整合素亞基與細胞外基質(zhì)分子LN、FN、Matrigel

11、識別、結合。
　　結論:CD82-SEL序列模擬寡肽既可抑制細胞外基質(zhì)分子刺激SW620細胞整合素亞基的表達,又可抑制整合素與細胞外基質(zhì)分子LN、 FN、Matrigel直接結合。從而抑制細胞對細胞外基質(zhì)分子的識別粘附。
　　四、目的：CD82-SEL序列模擬寡肽對SW620細胞粘著斑激酶酪氨酸殘基磷酸化的影響。粘著斑激酶(FAK)是整合素所介導的細胞信號轉(zhuǎn)導通路中的關鍵蛋白激酶。整合素與其配體結合以及粘著斑的形成使FAK磷

12、酸化活化,調(diào)節(jié)細胞的生長、增殖、分裂及遷移運動。
　　方法：為探討CD82-SEL序列模擬寡肽對SW620細胞運動、遷移的抑制機理,我們進一步觀察了CD82-SEL序列模擬寡肽對SW620細胞FAK酪氨酸殘基磷酸化的影響。
　　結果:(1)采用Western Blot技術檢測了SW620腫瘤細胞FAK各位點酪氨酸殘基磷酸化情況。結果顯示,SW620細胞FAK的397、407、576、577、861、925位酪氨酸殘基均發(fā)生磷

13、酸化。(2)細胞外基質(zhì)分子LN、FN、Matrigel可刺激SW620細胞FAK的397、407和861位酪氨酸殘基磷酸化,不影響FAK的925位酪氨酸殘基磷酸化。(3) CD82-SEL序列模擬寡肽抑制細胞外基質(zhì)分子LN、FN、Matrigel對SW620細胞FAK的397、407和861位酪氨酸殘基磷酸化的刺激作用。
　　結論:CD82-SEL序列模擬寡肽通過抑制SW620腫瘤細胞整合素與其細胞外配體結合,從而抑制FAK的磷酸