菌群及巨噬細胞脂質分解在血脂調節(jié)中的作用與機制.pdf

1、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（簡稱冠心?。┦侵欣夏曜畛Ｒ姷男难芗膊?，其主要病理基礎為動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)。隨著生活水平的提高和飲食習慣的改變，AS發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年升高的趨勢。
　　眾多流行病學研究顯示，血脂代謝紊亂和炎癥反應在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用，尤其是血液中低密度脂蛋白-膽固醇(Low Density Lipoprotein-Cholesterol，LDL-C)的升高已證實為動脈

2、粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的獨立危險因素。調控血脂水平的機制極其復雜，除了常見的遺傳及環(huán)境因素外，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，菌群在代謝性心血管疾病中起到了重要作用，干預菌群能夠預防、甚至臨床治愈代謝性心血管病，但菌群是否通過改變血脂代謝來影響心血管疾病的發(fā)生發(fā)展目前尚不明確，仍需要進一步研究。體內膽固醇平衡是由三條主要代謝通路控制，包括自身合成，膽汁糞便排出以及腸道吸收。腸道膽固醇吸收是尼曼匹克C1樣蛋白1(Niemann-Pick C1-Like1，NP

3、C1L1)蛋白介導的主動吸收過程，前期研究證實，NPC1L1基因敲除小鼠不僅有腸道膽固醇吸收缺陷，而且糞便量也明顯減少。菌群是糞便的重要組成部分，提示腸道菌群可能參與了NPC1L1基因調節(jié)體內膽固醇代謝的過程，但具體機制尚不清楚。
　　早期動脈粥樣硬化的重要特征是巨噬細胞來源的泡沫細胞在血管內皮下的沉積。泡沫細胞的主要成分是膽固醇酯和甘油三酯，CGI-58(Comparative gene identification-58)是細

4、胞內脂質分解的激活因子，主要通過激活脂肪甘油三酯水解酶(adiposetriglyceride lipase，ATGL)的活性促進細胞內脂質分解。前期研究發(fā)現(xiàn)，CGI-58缺失的巨噬細胞類似泡沫細胞，有大量的甘油三酯(Triglyceride，TG)和膽固醇酯沉積，并呈現(xiàn)促炎表型，但CGI-58導致的脂質紊亂和炎性改變是否對動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展產生影響目前尚無定論?？紤]到泡沫細胞與炎癥反應是動脈粥樣硬化發(fā)生的病理基礎，因此，研究巨噬細胞

5、CGI-58與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的相互關系至關重要。
　　目的：
　　1.探討菌群對體內膽固醇代謝平衡調節(jié)的影響及其在NPC1L1調節(jié)膽固醇吸收中的作用及相關機制，篩選與腸道膽固醇吸收相關的腸道菌群為今后進一步研究打下基礎。
　　2.建立巨噬細胞特異性CGI-58敲除的動脈粥樣硬化模型，在動脈粥樣硬化模型基礎上探討巨噬細胞CGI-58對脂質代謝及炎癥反應的影響及作用機制。
　　方法：
　　1.腸道菌群與小

6、鼠體內膽固醇代謝的相關性及可能的作用機制
　　1.1無菌(Germ-free，GF)小鼠是現(xiàn)階段研究腸道菌群與疾病相關性的一個必要模型，本研究第一部分動物模型選用無菌小鼠和普通無特殊病原體(Specificpathogen-free，SPF)小鼠，并按照在Western Diet中混合或者未混合膽固醇吸收抑制劑依折麥布(Ezetimibe)作為分組標準隨機分為SPF+WD飲食組，SPF+WD飲食+Ezetimibe組，GF+WD飲

7、食組，GF+WD飲食+Ezetimibe組。
　　1.2[14C]-cholesterol和[3H]-Sitosterol的同比例混合溶液被灌胃進入小鼠體內，運用雙同位素標記法檢測各組小鼠糞便中上述同位素的dpm計數(shù)，計算出各組小鼠膽固醇腸道吸收率的改變。將5-Cholestene，β-Coprostanl，α-Cholestanone，Cholesterol等膽固醇及其相關甾醇作為標準品，運用氣象色譜檢測等方法觀察計算各組小鼠糞

8、便中膽固醇相關甾醇排出量的情況。
　　1.3選取多種可靠的檢測試劑盒，采用萃取技術、酶學分析、ELISA等方法觀察小鼠體內血液及組織中生化學指標及膽固醇、甘油三酯、膽汁酸代謝的改變。
　　1.4選定相應的引物序列及抗體，運用Q-PCR、免疫印跡等檢測方法檢測與膽固醇、膽汁酸代謝相關基因mRNA及蛋白的表達，探索菌群的有無及膽固醇吸收抑制劑的參與對膽固醇及膽汁酸代謝可能的作用機制。
　　1.5聯(lián)合華大基因測序，選用宏基因

9、組檢測方法，篩選出可能的與腸道膽固醇吸收相關的腸道菌群菌屬。
　　2.探索巨噬細胞脂質分解在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的可能作用
　　2.1從條件性巨噬細胞CGI-58敲除和野生小鼠體內分離出腹腔及骨髓巨噬細胞，用動脈粥樣硬化危險因子對細胞進行干預，觀察這些危險因子對巨噬細胞CGI-58表達的影響及其與CGI-58相互作用對泡沫細胞形成的調控。
　　2.2建立巨噬細胞特異性CGI-58敲除的動脈粥樣硬化模型，在西方飲食的作

10、用下，進行體內實驗，觀察動脈粥樣硬化模型下巨噬細胞CGI-58敲除小鼠與未敲除小鼠血液學指標及其在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　結果：
　　1.腸道菌群可以通過調節(jié)小鼠宿主基因表達水平從而減少體內膽固醇丟失
　　1.1各組小鼠西方飲食和Ezetimibe共同作用后，無菌小鼠較同處理條件的SPF小鼠結腸重量明顯增加(P＜0.01)，但其體重、腹腔脂肪、皮下脂肪卻顯著減少(P＜0.05)。Ezetimibe的使用加速

11、了這種改變。同時發(fā)現(xiàn)，Ezetimibe喂養(yǎng)后，SPF小鼠糞便量降低，無菌鼠卻無同樣改變(P＜0.01)。
　　1.2雙同位素檢測和氣象色譜檢測結果發(fā)現(xiàn)，同樣處理條件下，無菌小鼠與SPF小鼠相比較，腸道膽固醇吸收率明顯降低(P＜0.05)，糞便中膽固醇及其細菌代謝產物排出量明顯增加(P＜0.05)。Ezetimibe在無菌小鼠中抑制膽固醇吸收和促進糞便膽固醇排泄的作用更強。
　　1.3通過對膽汁中的膽固醇、磷脂及膽汁酸的檢測

12、發(fā)現(xiàn)，GF與SPF小鼠相比較，膽汁中的膽固醇含量降低(P＜0.05)。在Ezetimibe處理下，膽汁膽固醇進一步降低，但兩組間沒有顯著變化。
　　1.4運用ELISA和酶學檢測方法測量了不同處理小鼠血液及肝臟中的膽固醇、甘油三酯及磷脂等脂質相關指標，發(fā)現(xiàn)GF小鼠血漿內的脂質含量均低于SPF小鼠(P＜0.05)，相較于SPF小鼠組，ezetimibe處理能夠更明顯的降低GF小鼠組內的膽固醇及甘油三酯的含量(P＜0.05)。肝臟脂質

13、相關指標研究結果提示，相較于SPF小鼠，GF小鼠肝臟中的游離膽固醇，總膽固醇，膽固醇酯，甘油三酯以及磷脂含量顯著降低(P＜0.05)。Ezetimibe處理后能顯著降低SPF小鼠和GF小鼠肝臟中的脂質含量，且GF小鼠反應更為明顯(P＜0.05)。
　　1.5在GF小鼠空腸內，與脂肪生成相關的基因如SREBP-1C，F(xiàn)AS以及SCD-1等表達均較SPF小鼠低(P＜0.05)。與膽汁酸激活相關的基因如FXR，OST-β以及FGF-15

14、在GF小鼠腸道內表達明顯下調(P＜0.05)。另外，與脂蛋白代謝和轉運相關的基因，如:HDL受體SR-BI在GF小鼠空腸內較SPF小鼠表達明顯增加(P＜0.01)，ezetimibe的處理進一步降低其表達水平;LDL受體在未用ezetimibe處理時SPF小鼠和GF小鼠小腸內未見明顯的mRNA改變，但ezetimibe處理后，其mRNA水平在兩組小鼠內表達均增加(P＜0.05)。同時，與膽固醇轉運及吸收相關的蛋白也有相應改變，ABCA1

15、和NPC1L1的mRNA和蛋白水平在GF小鼠內均降低(P＜0.05); ABCG5和ABCG8的mRNA和蛋白水平在GF小鼠內均顯著升高(P＜0.05)。Ezetimibe處理后除了降低了ABCA1的表達外，上述基因表達均為發(fā)生明顯改變。
　　1.6與SPF小鼠相比，GF小鼠肝臟中與膽固醇合成的酶，如HMG-CoA，HMGCR，HMGCS以及FPPS的mRNA表達均上調(P＜0.05)。Ezetimibe處理進一步升高這些基因在S

16、PF小鼠和GF小鼠中的表達(P＜0.05)。GF小鼠中感受細胞內膽固醇水平的核受體LXR的靶基因，如ABCA1，SREBP-1C以及SCD-1與SPF小鼠相比較均表達下調(P＜0.05)， Ezetimibe處理后GF小鼠上述基因表達下調更明顯(P＜0.05)。同時，脂蛋白受體基因如SR-BI和LDLR的mRNA及蛋白表達水平在GF小鼠肝臟中明顯增加(P＜0.05)。另外，在GF小鼠肝臟中，與膽酸代謝的相關基因如FXR mRNA表達下調

17、(P＜0.05); CYP7A1和CYP781 mRNA表達上調(P＜0.05)，CYP7A1蛋白表達也明顯增加。
　　1.7宏基因組測序結果顯示，NPC1L1基因敲除介導的腸道膽固醇吸收抑制在高脂飲食條件下能夠顯著改變腸道菌群的組成。
　　2.巨噬細胞脂質分解在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用研究
　　2.1 ox-LDL刺激下THP-1細胞中CGI-58蛋白表達明顯下調，同時，ox-LDL刺激原代巨噬細胞后，腹腔和骨髓

18、巨噬細胞內CGI-58的表達也明顯下降，以腹腔巨噬細胞改變更為明顯。對小鼠腹腔巨噬細胞進行熒光染色后發(fā)現(xiàn)，空白刺激情況下巨噬細胞CGI-58敲除后較未敲除組脂滴聚集增多，ox-LDL刺激下，未敲除CGI-58的細胞脂滴聚集增加，巨噬細胞CGI-58敲除后，脂滴聚集更為明顯。
　　2.2通過條件性基因打靶技術建立了巨噬細胞CGI-58和ApoE敲除小鼠模型，其基因型為ApoE-/-CGI-58f/f/cre+(DKO)。DKO小鼠與

19、對照鼠相比，體重增加和生育能力正常。通過檢測血漿中膽固醇及脂質代謝相關指標，西方飲食飼喂6周后，DKO小鼠相較對照組(ApoE-/-CGI-58f/f)小鼠血漿膽固醇和甘油三酯含量明顯增高(P＜0.01)。初步結果顯示，DKO主動脈斑塊數(shù)量較對照組有所增加。
　　2.3 DKO相較ApoE-/-和WT小鼠糖耐量降低(P＜0.05)，胰島素抵抗明顯增加(P＜0.05)，提示巨噬細胞CGI-58可能也參與了全身血糖代謝調節(jié)，但與動脈粥

20、樣硬化的關系有待進一步研究。
　　結論：
　　1.腸道菌群可能是體內膽固醇平衡調節(jié)的重要組成部分。
　　2.腸道菌群可以通過調節(jié)相關基因表達，增加腸道膽固醇重吸收，有效的防止體內膽固醇的大量流失。
　　3.厚壁菌門和擬桿菌門細菌的改變可能與NPC1L1調節(jié)膽固醇代謝相關。
　　4.動脈粥樣硬化危險因子ox-LDL能夠降低巨噬細胞內的CGI-58表達，同時巨噬細胞CGI-58可能參與了動脈粥樣硬化危險因子刺激