融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)對耐順鉑卵巢癌細胞影響及機制的研究.pdf

1、背景：
　　卵巢癌是目前死亡率最高的婦科惡性腫瘤，嚴重威脅婦女生命和健康，惡性程度高、起病隱匿、發(fā)現晚、易轉移、預后差是卵巢癌的特點。大約70％的患者就診時已經是晚期(FIGO分級Ⅲ-Ⅳ期)。腫瘤細胞減滅術和以順鉑為基礎的聯合化療是晚期卵巢上皮性癌綜合治療的重要手段，腫瘤細胞減滅術的目的是最大限度和范圍地切除腫瘤組織，但術后可能殘留的病灶仍然無法避免，且成為卵巢癌復發(fā)的重要因素。因此化療的應用使卵巢癌的治療效果大為改觀，患者生存質

2、量明顯改善，但綜合來看，患者5年內的生存率不超過30%，卵巢癌對化療藥物耐藥是導致患者治療失敗的主要原因。目前卵巢上皮性癌主要采用以順鉑為基礎的化療方案，但是順鉑的療效會因癌細胞內在或者后天(藥物誘導)獲得的耐藥性而減弱。因此，逆轉卵巢癌耐藥及卵巢癌耐藥機制的深入研究尤為重要。目前，分子靶向治療已逐漸成為一種新的腫瘤治療策略，并取得一定的研究成果。本題組前期采用全細胞差減法成功篩選獲得了與卵巢癌上皮細胞特異性結合的短肽（ovarian

3、cancer specific binding peptide，OSBP），通過原核表達的方法成功獲得了靶向融合肽﹛轉錄反式激活因子（trans-activator of transcription， TAT）-OSBP-絲裂原活化蛋白激酶激酶6突變體（E）[mitogen-activated protein kinase k inase6 mutant（E），MKK6（E）]﹜，TAT-OSBP-MKK6（E），是一種靶向卵巢癌上皮細

4、胞的具有強穿膜能力的靶向融合肽，體內實驗證明其能靶向介導卵巢癌細胞的凋亡，增強紫杉醇的抗腫瘤效應。本研究擬在前期研究的基礎上，以人卵巢癌順鉑耐藥細胞株SKOV3/DDP為研究對象，進一步探討TAT-OSBP-MKK6（E）對人卵巢癌順鉑耐藥細胞株 SKOV3/DDP生長的抑制作用及其可能的機制，并將其與順鉑聯合應用于 SKOV3/DDP細胞，觀察兩者的聯合抗腫瘤效應，為探索新的靶向殺滅卵巢癌細胞的藥物提供實驗數據，為逆轉卵巢癌順鉑耐藥的

5、研究提供理論依據。
　　目的：
　　利用人上皮性卵巢癌耐順鉑細胞株SKOV3/DDP細胞為研究對象，探討融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)單用或與順鉑(DDP)聯用對SKOV3/DDP細胞的抑制作用及其可能的分子機制。
　　方法：
　?。?）利用 MTT法檢測融合蛋白 TAT-OSBP-MKK6(E)對耐順鉑卵巢癌細胞株SKOV3/DDP的生長抑制作用，用 transwell檢測融合蛋白 TAT-OSBP-

6、MKK6(E)對耐順鉑卵巢癌細胞株SKOV3/DDP的侵襲與轉移的影響；Western blot分析P38MAPK蛋白的表達；
　?。?）MTT法檢測融合蛋白 TAT-OSBP-MKK6(E)聯合順鉑對耐順鉑卵巢癌細胞株SKOV3/DDP抑制作用是否增強，光鏡下觀察 TAT-OSBP-MKK6(E)聯合順鉑對SKOV3/DDP細胞的形態(tài)變化；流式細胞術檢測 TAT-OSBP-MKK6(E)聯合順鉑對SKOV3/DDP的凋亡率的影響

7、，Western blot分析細胞Cleaved caspase-3蛋白的表達;
　?。?）MDC染色標記 TAT-OSBP-MKK6(E)誘導 SKOV3/DDP發(fā)生自噬的自噬體；Western blot分析細胞 LC3-II蛋白的表達；利用自噬特異性抑制劑氯喹檢測 TAT-OSBP-MKK6(E)誘導SKOV3/DDP發(fā)生自噬的作用
　?。?）利用 P38MAPK信號通路特異性抑制劑 SB230580阻斷 P38MAPK

8、信號通路后，檢測P38蛋白和LC3-II蛋白的表達，MTT法檢測SKOV3/DDP細胞的生存率。
　　結果：
　　1.融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)對耐順鉑卵巢癌細胞株SKOV3/DDP的生長抑制作用
　　以2.5、5、10、20、40和80μmol/ml的TAT-OSBP-MKK6(E)處理SKOV3/DDP細胞48h，出現明顯的增殖抑制作用，且呈濃度依賴性。不同的濃度的TAT-OSBP-MKK6(E)處理

9、組與對照組相比較，均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），其IC50為26.94μmol/mL。
　　2. Transwell檢測融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)對耐順鉑卵巢癌細胞株SKOV3/DDP的侵襲與轉移的能力
　　以0、10、20和40μmol/ml的TAT-OSBP-MKK6(E)處理SKOV3/DDP細胞48h后，各處理組穿膜細胞數依次為(85±4)、(70±5)、(54±6)和(32±2)個，隨 TAT-O

10、SBP-MKK6(E)濃度的增加，其對SKOV3/DDP的侵襲抑制作用越明顯。不同的濃度的TAT-OSBP-MKK6(E)處理組與對照組相比較，均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。同樣遷移作用中，各處理組遷移細胞數依次為(708±15)、(683±14)、(141±15)和(113±18)個，隨TAT-OSBP-MKK6(E)濃度的增加，其對 SKOV3/DDP的遷移抑制作用越明顯。不同的濃度的TAT-OSBP-MKK6(E)處理組與對照

11、組相比較，均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）
　　3.融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)對耐順鉑卵巢癌細胞株SKOV3/DDP中P38MAPK的蛋白的表達
　　TAT-OSBP-MKK6(E)在（0-40）μmol/ml的各濃度中可以顯著激活SKOV3/DDP細胞中的磷酸化水平，并隨藥物濃度的增加磷酸化水平越明顯，且P38MAPK的總量并無改變。
　　4.融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)增加耐順鉑卵巢癌細胞

12、株SKOV3/DDP對順鉑的敏感性
　　5μmol/ml的TAT-OSBP-MKK6(E)單作用于 SKOV3/DDP細胞的生存抑制率為（13.06±1.089）%，此次20μg/ml順鉑對 SKOV3/DDP細胞的生存抑制率為（19.02±2.227）%，TAT-OSBP-MKK6(E)（5μmol/ml）+順鉑（20μg/ml）可以顯著提高 SKOV3/DDP細胞的生存抑制率達到（54.03±2.382）%。在倒置光學顯微鏡下

13、觀察結果顯示，順鉑聯合 TAT-OSBP-MKK6(E)能夠顯著抑制 SKOV3/DDP細胞的增殖， SKOV3/DDP細胞數量明顯減少，細胞形態(tài)發(fā)生改變，皺縮，細胞呈現為明亮的圓點。
　　5.融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)增加耐順鉑卵巢癌細胞株SKOV3/DDP細胞凋亡率
　　20μg/ml的順鉑，5μmol/ml的TAT-OSBP-MKK6(E)聯合作用 SKOV3/DDP細胞24h，利用流式細胞術檢測細胞凋亡

14、率。檢測結果發(fā)現，與對照組相比，20μg/ml順鉑并不能引起 SKOV3/DDP細胞發(fā)生明顯凋亡，5μmol/ml的TAT-OSBP-MKK6(E)能引起細胞凋亡率增加，但作用不明顯，而順鉑聯合 TAT-OSBP-MKK6(E)引起細胞凋亡率明顯增高。聯合組分別與順鉑組、融合蛋白組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但對照組及20μg/ml的順鉑組比較，順鉑聯合TAT-OSBP-MKK6(E)并沒有導致Cleaved Caspas

15、e-3蛋白表達增強，同樣單用5μmol/ml TAT-OSBP-MKK6(E)組中Cleaved Caspase-3蛋白表達減弱。
　　6.融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)誘導耐順鉑卵巢癌細胞株SKOV3/DDP細胞自噬20μg/ml的順鉑、5μmol/ml TAT-OSBP-MKK6(E)聯合組呈現了更高的熒光強度和更多的MDC標記的細胞。western blot檢測當20μg/ml的順鉑，5μmol/ml TAT-OS

16、BP-MKK6(E)單用或者聯合處理耐順鉑卵巢癌24h后，LC3-I逐漸向 LC3-II轉化，聯合組LC3-II蛋白濃度最高，而自噬流發(fā)生的標志性蛋白P62的表達則逐漸減弱。
　　7．融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)誘導耐順鉑卵巢癌細胞株SKOV3/DDP細胞自噬性細胞死亡
　　當氯喹（ chloroquine， CQ）和 TAT-OSBP-MKK6(E)聯用處理細胞后， LC3-II及P62的聚集較分別用 TAT-

17、OSBP-MKK6(E)單用時明顯增加，表明 CQ可以有效地阻斷自噬，引起自噬溶酶體內蛋白質的不斷堆積。MTT法的結果進一步顯示，自噬的抑制使TAT-OSBP-MKK6(E)對SKOV3/DDP細胞的抑制明顯下降。
　　8.融合蛋白TAT-OSBP-MKK6(E)通過激活P38MAPK通路誘導自噬增敏順鉑的抗腫瘤作用
　　SB203580作用使 P38蛋白表達下降，P38蛋白表達下降后，TAT-OSBP-MKK6(E)誘導的

18、LC3-I向LC3-II的轉化被顯著地抑制。進一步應用MTT法檢測不同處理組的細胞死亡數，結果顯示， TAT-OSBP-MKK6(E)聯合順鉑處理耐順鉑卵巢癌細胞SKOV3/DDP可以明顯增加細胞死亡，P38MAPK信號通路的抑制明顯阻斷了這一增敏作用。
　　結論：
　　融合蛋白 TAT-OSBP-MKK6(E)可以通過激活 P38MAPK信號通路，誘導自噬性細胞死亡的發(fā)生，從而抑制人卵巢癌順鉑耐藥細胞 SKOV3/DDP細