長鏈非編碼RNA遺傳變異與乳腺癌易感性關聯(lián)研究.pdf

1、乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，嚴重威脅全球女性健康。據統(tǒng)計，2012年女性新發(fā)乳腺癌逾167萬例，占所有新發(fā)惡性腫瘤的25.1％;由乳腺癌導致的死亡逾52萬例，占所有惡性腫瘤引起死亡的14.7％。在我國，乳腺癌發(fā)病率以每年3-5％的速度遞增，并且發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢。乳腺癌的發(fā)病機制較為復雜，目前普遍認為是遺傳與環(huán)境共同作用的結果。相同的環(huán)境危險因素暴露下僅部分個體最終發(fā)生乳腺癌，提示遺傳背景差異可能導致不同個體乳腺癌易感性不同。因此

2、，鑒定遺傳標志物以篩選具有遺傳易感性的乳腺癌高危人群，進而采取針對性的預防措施，對降低乳腺癌發(fā)病率和死亡率具有重要意義。
　　新近研究已證實長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)的異常表達參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，特定lncRNA可能作為腫瘤診斷的標志物和潛在的藥物靶點。LncRNA主要是通過與目標基因或特定蛋白的結合來發(fā)揮調控功能，基因組上lncRNA序列遺傳變異可能改變lncRNA自身的表達水平或

3、影響其與目標序列/蛋白的結合，繼而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此，本課題擬首先對乳腺癌癌和癌旁組織RNA進行全轉錄組測序（RNA sequencing，RNA-seq）以系統(tǒng)篩選異常表達的lncRNA，進而分析lncRNA上遺傳變異與乳腺癌易感性的關聯(lián)。
　　本課題研究設計包含兩部分內容:(1)測序篩選階段，采用illumina公司二代測序平臺Hiseq1500，針對5例乳腺癌新發(fā)患者的癌和癌旁組織RNA進行轉錄組測序。應用FastQC

4、軟件對測序數(shù)據進行質量控制，利用Bowtie/Tophat軟件對序列進行拼接，通過Tophat(v2.0.9)軟件將所得序列定位于人類基因組數(shù)據庫(hg19)上，注釋之后挑選出轉錄本長度大于200bp以上非編碼RNA，再通過Cuffiinks(v2.2.1)評價表達水平。應用R軟件DESeq2包進行差異表達分析，篩選顯著差異表達的lncRNA。(2)關聯(lián)研究階段，采用病例對照研究，納入1486例醫(yī)院來源的新發(fā)乳腺癌患者，1519健康對照

5、來自參加江蘇省城鄉(xiāng)慢性非傳染性疾病調查的人群，按年齡和居住地區(qū)（城鄉(xiāng)比例）等分布特征與病例頻數(shù)匹配。通過RegulomDB進行生物信息學預測，篩選lncRNA區(qū)域及其上下游2kb范圍內所有功能性遺傳變異，納入標準:RegulomeDB評分1-3;中國漢族人群中最小等位基因頻率(MAF)≥0.05;排除在中國人群中高連鎖不平衡(LD)的遺傳變異（r2＞0.8，優(yōu)先納入評分高的位點，如果評分一致，隨機選取）。利用Sequenom公司的Mas

6、sARRAY分子量陣列技術平臺對上述功能性遺傳變異進行基因分型。應用Logistic回歸模型在各遺傳模型下計算遺傳變異的關聯(lián)P值、比值比(odds ratio，OR)及其95％可信區(qū)間(confidence interval，CI)。
　　測序篩選階段共發(fā)現(xiàn)11個差異表達lncRNA位于常染色體區(qū)域、錯誤發(fā)現(xiàn)率(False discovery rate，F(xiàn)DR)校正P值≤0.05且對數(shù)轉換的表達差值(log2foldchange)

7、≥2。關聯(lián)研究階段納入27個潛在功能性遺傳變異，去除4個引物設計失敗和3個基因分型率低于95％，最終獲得20個位點的分型結果。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，位于lncRNA AC104135.3上遺傳變異rs11471161的TT等位基因與降低的乳腺癌風險顯著相關(相加模型:OR=0.86，95％CI=0.78-0.96，P=7×10-3);而位于lncRNA RP11-1060J15.4上遺傳變異rs3751232的A等位基因與升高的

8、乳腺癌風險顯著相關(相加模型:OR=1.26，95％CI=1.10-1.45，P=1×10-3);在校正了年齡、初潮年齡和絕經狀態(tài)之后，rs11471161和rs3751232仍然與乳腺癌風險相關(rs11471161，OR=0.84，95％ CI=0.74-0.94，P=4×10-3; rs3751232，OR=1.20，95％ CI=1.02-1.40，P=2.7×10-2)。分層分析結果發(fā)現(xiàn)，rs11471161在較低初潮年齡、較

9、低首胎活產年齡、絕經前和TNM中晚期乳腺癌患者中與降低的乳腺癌風險顯著相關（P值分別為0.012，0.023，0.042和0.026），且rs11471161只在雌激素受體(ER)陽性、孕激素受體(PR)陽性和人類表皮生長因子受體2（HER2）陰性的腫瘤亞組中表現(xiàn)為保護的效應（P值分別為0.006，0.018和0.008）;rs3751232則與ER+和PR+腫瘤亞組顯著增加的乳腺癌風險有關（P值分別為0.004和0.036）。但是遺傳

10、變異與乳腺癌的關聯(lián)在不同的亞組間皆不存在異質性（異質性檢驗P＞0.05）。此外，共表達分析發(fā)現(xiàn)AC104135.3與乳腺癌相關的基因ERBB2有顯著的共表達相關(r=0.99，F(xiàn)DR校正P=0.0149)。
　　本課題通過轉錄組測序技術建立乳腺癌lncRNA表達譜，并發(fā)現(xiàn)差異表達lncRNAAC104135.3和RP11-1060J15.4相關遺傳變異rs11471161和rs3751232與乳腺癌易感性顯著關聯(lián)。研究結果為乳腺癌