熒光分子探針技術在基因表達產物研究中的應用.pdf

1、現代科學認為：許多疾病的發(fā)生與細胞內的基因結構和表達水平變化有著直接的聯系。但是，如何借助有效的研究手段，從分子水平上實時、靈敏、特異地獲取這些信息變化，尤其是基因表達信息的變化，已經成為醫(yī)學研究所面臨的嚴峻挑戰(zhàn)，同時也為分析化學加強與醫(yī)學的融合提供了新的機遇。熒光分子探針技術作為一種靈敏、準確的研究手段和方法，結合生物大分子的一些特殊生化性質，如核酸雜交、核酸-蛋白質的相互作用、蛋白質(酶)對底物的特異性識別和切割等，將生物分子信息轉

2、變?yōu)橐子跈z測的熒光信號，有望在獲取基因表達產物信息方面取得突破。但是，由于受到熒光分子探針類型的限制和基因表達產物多樣性的影響，目前基于熒光分子探針檢測基因表達產物的方法還不多。因此，進一步發(fā)展可用于檢測基因表達產物的熒光分子探針新方法、新技術和新原理是一項非常有意義的前瞻性研究工作。 本論文以細胞中能降低腫瘤發(fā)生風險的一類基因表達產物損傷修復蛋白為研究對象，利用這些蛋白的催化功能，結合研制新型熒光分子探針，從檢測尿嘧啶糖苷酶(

3、UDG)著手，以發(fā)展操作簡單快速、靈敏度高、選擇性好、而且樣品量小的新方法為研究主線，利用新的雙鏈熒光探針建立了損傷修復蛋白UDG、APE1和T4DNA連接酶的活性分析新方法，利用已有的分子信標探針開展了損傷修復蛋白hOGG1活性分析；同時利用分子信標開展了基因表達產物mRNA的定量檢測研究。這種用于基因表達產物研究的熒光分子探針技術具有操作簡單、快速、可實時監(jiān)測等優(yōu)點，一定程度上克服了基于放射性標記、凝膠電泳等經典分析方法費時、費力以

4、及無法實時獲取基因表達產物信息的缺陷。論文主要內容歸納如下： 第一部分熒光分子探針用于基因表達產物堿基損傷修復蛋白的檢測1、利用雙鏈熒光探針建立了簡單快速的UDG酶活性分析的新方法。UDG酶是一種能特異消除損傷堿基尿嘧啶的蛋白，在防止基因突變，調節(jié)免疫功能等方面具有重要意義。目前采用的放射性標記和電泳分析UDG酶活性的方法，不利于酶促反應過程實時監(jiān)測和活性分析。本章設計雙鏈熒光探針作為切割底物和檢測分子，通過監(jiān)測尿嘧啶切割過程中

5、溶液熒光信號的變化，建立了UDG酶高靈敏分析方法，檢測下限可達0.033U/mL：考察了反應溶液中金屬離子、化學藥物以及底物濃度等條件變化對切割反應初速度的影響，開展了UDG酶促反應機制和動力學過程研究；這種新方法還可快速、準確檢測腫瘤細胞中UDG酶活性，檢測靈敏度與放射性同位素法相當。以上結果不僅證明熒光分子探針技術用于堿基損傷修復蛋白活性檢測的可行性，而且有望為臨床診斷提供新的輔助手段。 2、利用雙鏈熒光探針建立了簡單、快速

6、的APE1酶活性分析的新方法。APE1是細胞中水解AP位點的糖苷酶，主要參與堿基損傷修復、調節(jié)細胞周期、細胞凋亡等生命過程。為了避免傳統(tǒng)的APE1酶活性分析方法操作復雜、費時的缺陷，我們以含有AP位點的雙鏈熒光探針作為反應底物，在均相溶液中實時監(jiān)測AP位點水解反應過程，建立了一種APE1酶活性分析的新方法，其線性檢測范圍為0.024-2U/mL，檢測下限為0.024U/mL；通過考察和優(yōu)化溶液的金屬離子、化學藥物以及底物濃度等實驗條件，

7、在均相溶液中實現了酶促反應機制和動力學過程研究；這種新方法還可用于腫瘤細胞中APE1活性水平的檢測，與其他方法相比，該方法不僅靈敏度達到放射性同位素法的水平，而且特異性強、檢測結果準確，有望在腫瘤早期診斷上發(fā)揮重要作用。 3、利用雙鏈熒光探針建立了DNA連接酶活性分析的新方法。核酸連接是生命科學中倍受關注的生命活動。其活性分析和機理研究有助于進一步拓展核酸連接反應在疾病檢測、基因載體及核酸修飾與分析等方面的應用。利用雙鏈分子探針作為核酸

8、連接的模板和信號分子，通過實時監(jiān)測熒光信號降低來監(jiān)測T4DNA連接酶反應過程，為連接酶活性分析、連接機理及其動力學過程研究提供了一種簡便快捷的方法。 4、利用單鏈探針分子信標建立了簡單、快速的hOGG1酶活性分析的新方法。根據hOGG1酶能切割損傷堿基8-oxoG和裂解DNA鏈雙重功能的特性，將8-oxoG設計在分子信標莖部，發(fā)展了一種可作為hOGG1酶底物的新型熒光探針。通過實時監(jiān)測hOGG1酶識別切割8-oxoG后引起的溶液

9、熒光信號變化，建立了一種分析hOGG1酶活性的新方法，檢測線性范圍為0.0125-5U/mL，檢測下限為0.0125U/mL；通過考察和優(yōu)化反應溶液中金屬離子、化學藥物以等實驗條件，開展了hOGG1酶促反應機制和動力學過程研究；這種新的熒光分析方法用于多種腫瘤細胞hOGG1活性水平準確檢測的結果表明：這種新方法可望為臨床腫瘤早期診斷提供輔助手段。 第二部分熒光分子探針用于基因表達產物mRNA的檢測5、利用分子信標體外定量檢測腫瘤

10、抑制基因ING1 mRNA的表達?；谀[瘤抑制基因ING1 mRNA的序列保守區(qū)設計合成分子信標，將其與體外轉錄的ING1RNA雜交，得到了ING1分子信標/RNA雜交標準曲線；通過考察雜交緩沖溶液的離子強度、pH值以及其他核酸分子對分子信標與細胞mRNA雜交過程的影響和體系優(yōu)化，在均相溶液中實現了ING1 mRNA表達水平的定量檢測，并利用RT-PCR法驗證了檢測結果。與其他mRNA檢測方法相比，該方法簡單、快速，而且檢測過程不經過擴