中國林蛙皮膚生物活性肽基因的cDNA克隆、序列分析及生物活性的測定.pdf

1、兩棲類皮膚中含有種類繁多、功能復雜的生物活性物質，用來抵御有害環(huán)境因子的侵襲，是極具開發(fā)潛力的生物資源寶庫。中國擁有豐富的兩棲類資源，在將近300個亞種中，其中三分之二是特有種，在生物活性物質開發(fā)方面具有極大的潛力。但是，由于兩棲類皮膚生物活性肽在其組織中含量少，分離獲得大量的天然產物又很困難，往往不能滿足進一步研究的需要。利用分子生物學技術篩選活性肽就成為必然選擇，豐富了兩棲類活性物質資源庫，并為進一步研究活性肽表達及分離純化奠定基礎

2、。
　　 本論文以遼寧省撫順市新賓縣地區(qū)的中國林蛙作為試驗材料，從中國林蛙皮膚中得到一系列活性肽基因的cDNA序列，并利用生物信息學方法初步分析活性肽基因的序列及結構，進而研究各活性肽的生物活性，為兩棲動物活性肽的開發(fā)和利用奠定理論基礎。
　　 首先，根據GenBank中蛙類皮膚生物活性肽信號肽N-端保守序列，設計引物，采用RT-PCR和3’-RACE方法，從中國林蛙皮膚總RNA中克隆出了6條編碼不同活性肽前體的cDNA

3、序列，經NCBI數據庫中的Blast軟件，進行氨基酸序列同源性比較之后，分別命名為：prcprotemporin-1CEa、preprotemporin-1CEb、preprotemporin-1CEc、preprobrevinin-1CEa、preprobrevinin-1CEb和preprochensinin-1。
　　 序列分析結果表明，6條編碼中國林蛙皮膚生物活性肽前體的cDNA序列全長為289-315bp，編碼59-6

4、5個氨基酸。其前體由3部分結構域組成：22個氨基酸殘基組成的信號肽、多個酸性氨基酸殘基組成的中間序列、高度變異的成熟肽。preprotemporin-1CEa、preprotemporin-1CEb和preprotemporin-1CEc屬于temporin-1家族抗菌肽前體，具有肽鏈短，C-端酰胺化的特點；preprobrevinin-1CEb和preprobrevinin-1CEa屬于brevinin-1家族抗菌肽前體，在肽鏈的C-

5、端含有RANA盒結構，可在2個半胱氨酸殘基間形成二硫鍵，組成7肽環(huán)；preprochensinin-1在已知多種數據庫中沒有發(fā)現序列同源的多肽，被鑒定為新生物活性肽。
　　 人工合成temporin-1CEa、temporin-1CEb、brevinin-1CEa和chensinin-1四種中國林蛙皮膚生物活性肽，抗菌和抗癌活性檢測結果表明：它們對金黃葡萄球菌等3種革蘭氏陽性細菌的生長具有明顯抑制作用，同時抑制乳腺癌MCF-7細