慢性應激肝郁脾虛模型大鼠下丘腦弓狀核攝食相關神經肽變化機制研究.pdf

1、目的:在前期實驗研究基礎上，本課題通過慢性束縛應激方法來建立肝郁脾虛證候動物模型，以免疫熒光雙染、激光共聚焦成像、實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)等技術與方法，從基因與蛋白水平，分析下丘腦弓狀核（Arcuate nucleus，ARC）中具有抑制攝食作用的瘦素受體(ob-R)、可卡因-安非它明調節(jié)轉錄因子(Cocaine amph-etamine-regulated transc

2、ript，CART)、前阿黑皮(Proopiomelanocortin，POMC)、α-促黑素細胞激素(α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH)的表達，為肝郁脾虛證候機體所表現的食欲下降、體重減輕、便溏等脾胃運化功能失常的生物學基礎提供實驗依據;同時以中藥復方逍遙散（《太平惠民和劑局方》）作為干預用藥，揭示其疏肝解郁、健脾以調節(jié)食欲的作用靶點與機理。
　　方法:SD大鼠隨機分為4組，即正常對照

3、組（簡稱正常組）、7天模型組、21天模型組、逍遙散組。正常組大鼠不施加應激措施，正常飼養(yǎng);7天模型組、21天模型組大鼠分別予每天連續(xù)3h、連續(xù)7天、21天的慢性束縛應激方法（將大鼠束縛固定于特制的T型臺）建立動物模型;逍遙散組大鼠慢性束縛應激21天同時予灌服中藥復方逍遙散。7天模型組于實驗第8天取材;正常組、21天模型組與逍遙散組于實驗第22天取材。動態(tài)觀測4組大鼠體重、攝食量、飲水量、外觀表征和行為學變化（曠場試驗、高架十字試驗）。以

4、免疫熒光雙染、激光共聚焦成像、RT-qPCR等技術與方法，觀測大鼠下丘腦ARC中ob-R、CART、POMC、α-MSH基因和蛋白表達。
　　結果:
　　1大鼠一般外觀表征與行為學的變化
　　與正常組大鼠比較，模型組大鼠體重、攝食量、飲水量呈緩慢增長的趨勢;一般外觀表現出現嗜睡懶動、反應遲鈍、皮毛枯黃晦暗、耳廓爪部色澤變淡、大便干濕不調等變化;在束縛造模第0天，曠場試驗各組大鼠5min內總穿格數、中央區(qū)停留時間、站立次

5、數、修飾次數基本處于同一水平，隨著實驗進程，模型組大鼠的中央區(qū)停留時間明顯增加，總穿格數、站立次數、修飾次數呈現減少的趨勢。高架十字試驗各組大鼠進入開放臂次數、開放臂停留時間、進入封閉臂次數、封閉臂停留時間基本無差別，隨著實驗進程，模型組大鼠進入開放臂次數和開放臂停留時間呈下降趨勢，進入封閉臂次數及封閉臂停留時間呈現增加的趨勢，而逍遙散組大鼠體重、攝食量、飲水量、行為學各項指標的改善比較明顯，一般外觀表征也有顯著改善作用。
　　2

6、免疫熒光雙染觀測各組大鼠下丘腦ARC中ob-R、CART、POMC、α-MSH蛋白表達變化
　　在整個實驗過程中，隨著束縛的持續(xù)施加，21天模型組大鼠下丘腦ARC中ob-R、CART、POMC、α-MSH的表達陽性面積、平均光密度、積分光密度、陽性細胞數均較正常組增加，CART、POMC、a-MSH與ob-R共染面積的表達亦較正常組增加;灌服3周逍遙散后，各項指標均有下降趨勢，尤以ob-R與CART明顯。
　　3 RT-qP

7、CR觀測各組大鼠下丘腦ARC中ob-R mRNA、CART mRNA、POMC mRNA、α-MSH mRNA表達變化
　　在整個實驗過程中，隨著束縛的持續(xù)施加，21天模型組大鼠下丘腦ARC中ob-R mRNA的表達較正常組明顯增加（P＜0.01），但CART mRNA、POMC mRNA、α-MSH mRNA的表達較正常組增加，無統計學意義(P＞0.05)。逍遙散可以下調大鼠下丘腦ARC中ob-R mRNA、CART mRNA、

8、POMC mRNA、α-MSH mRNA的表達。
　　結論:
　　121天模型組大鼠下丘腦ARC中ob-R、CART、POMC、α-MSH蛋白與基因處于高表達水平，尤以ob-R明顯，表明ob-R的蛋白與基因表達下降，是慢性應激肝郁脾虛狀態(tài)機體出現食少、腹脹、便溏等脾胃失于健運的主要內在的中樞調節(jié)機制，7天模型組各指標較正常組增加不明顯，表明慢性制動束縛7天，模型以肝郁樣改變?yōu)橹鳌?br>　　2灌服逍遙散后，下丘腦ARC中ob