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文檔簡介
1、目的:
1.探討TRB3在C57BL/6小鼠纖維化中的作用。
2.外源性調控TRB3對博來霉素誘導的C57BL/6小鼠肺間質纖維化的影響,進一步在MAPK信號通路中探討三者之間的關系。
方法:
1.實驗分組:①單純對照組+生理鹽水(Mock組,對照組)②纖維化組+生理鹽水(fibrosis control組,F(xiàn)組)③纖維化+GFP組(F+GFP組)④纖維化+Ad-TRB3過表達組(F+TRB3組)
2、⑤纖維化+Ad-TRB3-shRNA干擾組(F+sh-TRB3組)。
2.動物造模:博來霉素3.5mg/kg氣管注入,造模次日,進行腺病毒尾靜脈注射,分別于第7、14和28天處死實驗小鼠一批,收集BALF、肺組織標本供實驗用。
3.肺組織HE/Masson染色形態(tài)學觀察及纖維化評分,進行羥脯氨酸測定進一步明確膠原蛋白含量。ELASIA檢測肺組織中CollaⅠ/Ⅲ的表達。免疫組化明確間質及上皮相關蛋白的表達。對肺泡灌洗
3、液(BALF)進行細胞分類及計數(shù)。
4.用Western blot方法從蛋白水平檢測C57BL/6小鼠TRB3、p-ERK1/2、ERK1/2、p-p38MAPK、p38MAPK及EMT相關蛋白(如E-cadherin、Fibronectin、Vimentin、α-SMA)的表達情況;用RT-qPCR從mRNA水平檢測TRB3、proCollaⅠ/Ⅲ的表達。
結果:
1.成功地構建出博來霉素誘導的小鼠肺纖維
4、化模型。
2.肺組織HE/Masson染色形態(tài)學觀察及纖維化評分,肺組織進行羥脯氨酸測,結果顯示:TRB3過表達纖維化程度更重,TRB3表達下調纖維化程度明顯減輕。BALF中,TRB3過表達表現(xiàn)出細胞總數(shù)、中性粒細胞數(shù)明顯增多,巨噬細胞減少。TRB3表達下調組結果相反。
3.Western blot檢測各組肺組織TRB3、p-ERK1/2、ERK1/2、p-p38MAPK、p38MAPK及EMT相關蛋白(如E-cad
5、herin、Fibronectin、Vimentin、α-SMA)的表達,RT-qPCR檢測TRB3、proCollaⅠ/ⅢmRNA的表達,結果顯示:TRB3過表達組的p-ERK1/2、ERK1/2、p-p38MAPK、p38MAPK及EMT相關蛋白及proCollaⅠ/ⅢmRNA的表達上調;而TRB3表達下調組結果相反。
結論:
1.TRB3過表達可增加EMT相關蛋白及mRNA的表達,TRB3基因表達下調后,結果相
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