擬黑多刺蟻和意大利蜜蜂雌激素相關受體基因的克隆與表達研究.pdf

1、核受體組成一個蛋白質(zhì)大家族，它們作為配體調(diào)節(jié)的轉錄因子，能夠直接與DNA結合，調(diào)節(jié)下游靶基因的表達。在這個大家族里面，有一些受體分子沒有已知的配體，稱它們?yōu)楣聝汉耸荏w。雌激素相關受體(ERR α, ERRB，andERRγ)屬于孤兒核受體，在結構上和ER非常類似，它們和ER共同構成核受體超家族的第三亞族，它們能夠直接與類固醇激素受體共激活子結合激活靶基因的表達。研究表明，哺乳動物ERRs參與ER信號通路，與眾多生理和發(fā)育過程有關，參與細

2、胞的增殖與分化。擬黑多刺蟻和意大利蜜蜂屬于社會性昆蟲，它們與人類關系密切，是重要的資源昆蟲，對于它們生殖與發(fā)育的相關研究具有重要的現(xiàn)實意義。本研究以擬黑多刺蟻和意大利蜜蜂為研究材料，采用RT-PCR、5’與3'Race、熒光實時定量PCR和原位雜交等實驗方法對這兩種昆蟲雌激素相關受體基因進行了克隆和表達研究，以期為進一步的探討昆蟲中雌激素相關受體的功能奠定基礎。研究結果如下： 1．擬黑多刺蟻雌激素相關受體基因pvERR全長193

3、5bp，包含一個1305bp的開放閱讀框、245bp的5’-UTR和385bp的3’-UTR，編碼一個由434個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量49.0989KD，理論等電點為6.62。pvERR基因有八個外顯子和七個內(nèi)含子。將pvERR基因核苷酸序列上傳Genbank，序列號為：EF474463。 2．意大利蜜蜂雌激素相關受體基因amERR全長1779bp，包含一個1305bp的開放閱讀框、197bp的5’-UTR和277bp的3’

4、-UTR，編碼一個由434個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量49.131KD，理論等電點為7.43。amERR基因有八個外顯子和七個內(nèi)含子。將amERR基因核苷酸序列上傳Genbank，序列號為：EF506198。 3．同源性分析表明，pvERR和amERR的氨基酸序列相似性為89.9％；它們的氨基酸序列與三種雙翅目昆蟲(埃及伊蚊aaERR、斯氏按蚊asERR和黑腹果蠅dERR)ERRs的相似性都在50.2％～53％之間；它們與人類三

5、種ERRs的相似性在37.6％～44％之間?；贜J法構建的進化樹顯示，pvERR和amERR形成一支，與所有已知的昆蟲ERRs聚在一起；它們與人類ERRs的關系比雙翅目昆蟲與人類的更近，也就是說，單從ERRs來看，在進化關系上，pvERR和amERR比aaERR、asERR和dERR都要進化。 4．采用APSSP2法對pvERR和amERR蛋白的二級結構預測結果表明，在pvERR和amERR蛋白的DNA結合區(qū)(DBD，105～

6、177)，有四個B折疊和三個α螺旋，主要由序列中位于110、113、117、120位的半胱氨酸(Cys，C)形成第一個鋅指結構；由位于136、142、152、155位的半胱氨酸(Cys，C)形成第二個鋅指結構。pvERR和amERR蛋白的配體結合區(qū)(LBD，206～429)，主要由兩個β折疊和11個α螺旋(H1～H12)構成，而多數(shù)ERR的LBD是一個由12個α螺旋(H1～H12)形成的三明治式的結構，通過比對，發(fā)現(xiàn)pvERR和amER

7、R蛋白都缺少H2，這與哺乳類已知晶體結構的ERR),的配體結合區(qū)結構非常類似。 5．采用SwissModel First Approach對pvERR和amERR蛋白的三級結構預測結果表明，pvERR和amERR蛋白的DBD結構與人類ERRB的DBD結構非常相似；amERR與pvERR的LBD的空間結構差別是amERR的最后一個α螺旋是向模型內(nèi)部伸入的，而pvERR的則是向外伸出的，這與它們的親水性有關。配體結合區(qū)的AF-2恰好

8、是在最后一個α螺旋區(qū)(H11)，AF-2的結構和功能因結合的配體類型不同而不同，所以這說明amERR與pvERR的配體存在一定的差異。 6．采用2<'-△△CT>法，對擬黑多刺蟻不同發(fā)育階段和不同品級中pvERR mRNA和意大利蜜蜂不同發(fā)育階段和不同品級中amERR mRNA的表達量進行相對定量分析，結果顯示，隨著昆蟲發(fā)育，pvERR和amERR基因的mRNA表達量逐漸增加，成蟲中的表達量高于幼蟲期；在不同品級中，蟻后pvER

9、R mRNA的表達量高于工蟻和雄蟻，雄蟻中的最低；蜂王amERR mRNA的表達量高于工蜂和雄蜂，雄蜂中的最低。結果表明，社會性昆蟲雌激素相關受體基因mRNA的表達模式非常相似，ERR可能與社會性昆蟲的發(fā)育有關；pvERR和amERR基因的mRNA在蛹期到成蟲期相對表達量有了顯著增加，可能說明它們在成蟲的組織分化中具有重要作用；成蟲階段pvERR和amERR基因的mRNA表達量均高于幼蟲期，說明昆蟲組織中ERR可能與哺乳動物的ERRs一

10、樣分布比較廣泛，而不同品級間的表達差異可能與它們在社會性群體中的職能有關。 7．對擬黑多刺蟻不同品級腦中pvERR mRNA的表達進行原位雜交檢測，結果顯示，pvERR mRNA在不同品級的蕈形體、附葉、視葉、中腦、食道下神經(jīng)節(jié)和球狀細胞中有表達。在蟻后腦中，蕈形體和球狀細胞中pvERR mRNA的陽性表達最為明顯，食道下神經(jīng)節(jié)、附葉和視葉中的次之，而中腦和中央體中的表達最弱。pvERR mRNA的表達模式可能與蟻后在蟻群中的職

11、能和地位是相關的，說明pvERR可能與視覺方面的學習記憶以及求偶調(diào)節(jié)等有關。在工蟻腦中，蕈形體、視葉、附葉和球狀細胞中的陽性反應強度跟蟻后相似，但是在中腦的陽性反應強度明顯高于蟻后和雄蟻。工蟻在蟻群中的行為最為復雜，pvERR mRNA在工蟻蕈形體及中腦的表達模式，可能說明pvERR與工蟻的嗅覺辨別以及學習與記憶功能有關。與蟻后和工蟻相比，pvERR mRNA在雄蟻蕈形體、附葉以及食道下神經(jīng)節(jié)的表達強度弱于蟻后和工蟻，但視葉中有較強的表

12、達。雄蟻的職責是與蟻后交配，而視覺信息在求偶過程中具有重要作用，所以推測pvERR mRNA在視葉和蕈形體的表達與視覺信息的整合有關，進而對求偶行為起調(diào)控作用。 8．采用地高辛標記的特異性寡核苷酸探針對擬黑多刺蟻性腺中pvERR mRNA的表達進行了原位雜交檢測，結果顯示，pvERR mRNA在卵子發(fā)生過程中濾泡細胞的胞質(zhì)和生長期、卵黃發(fā)生期的卵母細胞有表達；在變形期的精細胞胞質(zhì)和成熟精子頭部有很強的表達。在卵子發(fā)生早期階段，

13、濾泡細胞中pvERR mRNA的陽性表達可能與它們自身的增殖和分化有關。卵母細胞生長階段，濾泡細胞和卵母細胞中pvERR mRNA的表達模式可能說明濾泡細胞給卵母細胞提供了發(fā)育信息，而卵黃生成期卵母細胞中pvERR mRNA的表達可能說明pvERR與卵黃物質(zhì)的形成有關。變形期的精細胞胞質(zhì)和成熟精子頭部有很強pvERR mRNA的表達，說明pvERR可能參與了精細胞的發(fā)育調(diào)控和精子的成熟。 本項研究首次發(fā)現(xiàn)在社會性昆蟲中存在雌激素