潮汕地區(qū)漢族群體10個(gè)新Y染色體STR基因座的遺傳多態(tài)性及復(fù)合擴(kuò)增研究.pdf

1、目的：旨在篩選更多新的Y-STR基因座，提高Y-STR單倍型的鑒別能力。選取10個(gè)新Y-STR基因座，對(duì)其中適合MiniSTR引物設(shè)計(jì)的基因座，進(jìn)行MiniSTR引物設(shè)計(jì)；通過對(duì)10個(gè)Y-STR基因座在潮汕地區(qū)漢族群體中的遺傳多態(tài)性調(diào)查，分析它們的等位基因序列和單倍型，為等位基因命名提供依據(jù)，為法醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)；根據(jù)群體調(diào)查結(jié)果，選出其中符合條件的基因座，應(yīng)用銀染復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)，組建Y-STR復(fù)合擴(kuò)增體系，依據(jù)DNA分析技術(shù)工作組(

2、TWGDAM)指南進(jìn)行法醫(yī)學(xué)可行性研究，以建立檢測(cè)結(jié)果可靠、具有較高個(gè)人識(shí)別能力的檢測(cè)方法。
　　 方法：利用BLAT軟件對(duì)GDB數(shù)據(jù)庫中的Y-STR基因座進(jìn)行種屬特異性分析，依據(jù)具有良好種屬特異性、重復(fù)序列為單拷貝、重復(fù)單位為四或五核苷酸的原則，篩選出10個(gè)新Y-STR基因座DYS522、YS549、DYS556、DYS565、DYS568、DYS570、DYS588、DYS593、DYS594、DYS598；用primer

3、3.0軟件和BLAT軟件，根據(jù)Y-MiniSTR引物設(shè)計(jì)原則，對(duì)DYS565、DYS568、DYS593、DYS594和DYS598基因座重新進(jìn)行MiniSTR引物設(shè)計(jì)，其它基因座引物則采用GDB的引物序列。應(yīng)用PCR反應(yīng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)DNA樣本進(jìn)行單基因座PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用非變性聚丙烯酰胺凝膠連續(xù)緩沖體系垂直電泳分型，銀染法顯色檢測(cè)；用女性樣本和常見動(dòng)物樣本，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)10個(gè)Y-STR基因座的Y染色體特異性和種屬特異性；對(duì)潮汕地區(qū)漢族1

4、59名無關(guān)男性個(gè)體樣本進(jìn)行分型檢測(cè)，各基因座的等位基因測(cè)序后，按國際法醫(yī)遺傳學(xué)會(huì)(ISFG)推薦的命名原則命名；采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算10個(gè)Y-STR基因座的等位基因頻率和單倍型頻率；用家系樣本、毛干樣本DNA作為模板，檢測(cè)Y-STR基因座的突變率和分析降解DNA的能力。在群體調(diào)查結(jié)果基礎(chǔ)上，依據(jù)銀染復(fù)合擴(kuò)增位點(diǎn)選擇的原則，選出符合條件的Y-STR基因座，通過優(yōu)化復(fù)合擴(kuò)增條件，建立復(fù)合擴(kuò)增體系；擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用非變性聚丙烯酰胺凝膠連續(xù)緩沖體系垂

5、直電泳分型、銀染顯色檢測(cè)；用不同DNA含量樣本、不同組織樣本、不同載體上的血痕作模板，對(duì)復(fù)合擴(kuò)增體系進(jìn)行測(cè)試。
　　 結(jié)果：⑴應(yīng)用e-PCR對(duì)10個(gè)基因座進(jìn)行種屬特異性分析，各基因座的DNA序列只與人類基因組DNA完全匹配，未見其他動(dòng)物基因組DNA中存在相同序列；用10個(gè)Y-STR基因座的引物，擴(kuò)增女性樣本和常見動(dòng)物樣本DNA，均未檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物。⑵10個(gè)Y-STR基因座的擴(kuò)增產(chǎn)物均只檢測(cè)到一條帶，非特異性產(chǎn)物少，分型效果良好。

6、⑶10個(gè)Y-STR基因座除DYS588和DYS593外，其余均為簡(jiǎn)單重復(fù)序列Y-STR。它們?cè)诔鄙堑貐^(qū)漢族人群中的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在108~372bp之間，其中DYS593擴(kuò)增片段長(zhǎng)度最小，DYS522最大。⑷潮汕地區(qū)漢族159名無關(guān)男性個(gè)體中，DYS522、YS549、DYS556、DYS565、DYS568、DYS570、DYS588、DYS593、DYS594、DYS598基因座分別檢測(cè)出7、5、5、4、6、9、8、4、4、4個(gè)等位基

7、因，基因變異度在0.1434 (DYS565)~0.7994 (DYS570)之間；10個(gè)Y-STR基因座，共觀察到138種不同的單倍型，單倍型變異度為0.9973，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.00069。通過30個(gè)2代父子家系樣本分析，10個(gè)Y-STR基因座單倍型一致，未觀察到突變。⑸10個(gè)Y-STR基因座中擴(kuò)增片段長(zhǎng)度小于130bp的DYS565、DYS568、DYS593、DYS598基因座，可對(duì)毛干DNA進(jìn)行檢測(cè)分型。⑹選出了5個(gè)Y-STR基因

8、座建立兩組Y-STR復(fù)合擴(kuò)增銀染檢測(cè)體系：MultiplexⅠ為DYS549、DYS556和DYS594，MultiplexⅡ?yàn)镈YS570和DYS593；電泳結(jié)果顯示：兩組Y-STR銀染復(fù)合擴(kuò)增體系的各基因座間擴(kuò)增產(chǎn)物平衡，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后可對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確分型，且與單基因座擴(kuò)增結(jié)果一致。法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究結(jié)果顯示：兩組復(fù)合擴(kuò)增體系具有良好的男性特異性和較高的種屬特異性，最低DNA檢出量達(dá)0.5ng；同一個(gè)體不同組織器官DNA分型結(jié)

9、果一致；對(duì)涂在不同載體上的血痕可進(jìn)行分型，同一樣本分型一致。經(jīng)群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，5個(gè)基因座在潮汕地區(qū)漢族159名男性樣本中共觀察到97種單倍型，單倍型變異度為0.99，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.0013。
　　 結(jié)論：①篩選的10個(gè)Y-STR基因座都是單拷貝的Y染色體特異性STR基因座，具有很好的種屬特異性和穩(wěn)定的父系遺傳，可用于法醫(yī)學(xué)混合斑跡分析和父權(quán)關(guān)系的鑒定。②分析了10個(gè)Y-STR基因座的等位基因序列，調(diào)查了它們?cè)诔鄙堑貐^(qū)漢族人群中

10、的遺傳多態(tài)性，為比較不同群體間的數(shù)據(jù)提供了依據(jù)，豐富了我國人類遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫。③10個(gè)Y-STR基因座的單倍型變異度為0.9973，其構(gòu)成的單倍型具有較高的個(gè)人識(shí)別率和非父排除率，能夠有效提高Y染色體的鑒別能力。④證實(shí)了小于130bp的小片段MiniSTR可對(duì)毛干DNA進(jìn)行檢測(cè)分型，提示對(duì)于高度降解的DNA檢材能夠準(zhǔn)確分型。⑤建立了兩組Y-STR復(fù)合擴(kuò)增銀染檢測(cè)體系：MultiplexⅠ和MultiplexⅡ；兩組體系檢測(cè)結(jié)果可靠，價(jià)格低