從分子、細胞和動物水平研究鉛誘發(fā)氧化損傷及細胞凋亡的效應與機理.pdf

1、隨著現(xiàn)代工業(yè)的快速發(fā)展，含鉛制品的種類和使用量越來越多，帶來的污染也越來越重。盡管各國政府已經(jīng)采取多項措施限制和減少鉛的使用，鉛污染引發(fā)的健康問題依舊非常突出，已經(jīng)成為當前社會高度關注的環(huán)境與健康問題之一。鉛能夠通過水、空氣、食物鏈富集等途徑與人體和動物體廣泛接觸，進而通過消化道、呼吸道和皮膚等吸收進入人體，經(jīng)血液循環(huán)系統(tǒng)分布到全身器官，引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)、肝、腎、大腦等多系統(tǒng)性、多器官性的機體損傷。
　　氧化應激是所有疾病發(fā)生的誘因。

2、研究表明鉛類污染物對生命體的危害與氧化應激效應密切相關。鉛暴露使機體產(chǎn)生過量的活性氧物質導致體內氧化還原平衡態(tài)被打破，造成蛋白質、核酸、脂類等生物大分子的氧化損傷，從而導致細胞凋亡或壞死和代謝紊亂，引發(fā)機體病變甚至癌癥的發(fā)生。環(huán)境污染物誘發(fā)機體的毒性效應首先發(fā)生在分子水平上，后呈現(xiàn)細胞乃至機體效應。因此，有必要從生物大分子、細胞和實驗動物三個層面闡明鉛暴露誘發(fā)機體氧化損傷的作用機理，從而揭示鉛暴露損害健康的微觀機制。
　　本文從鉛

3、毒性與氧化應激的相關性這一科學問題入手，以分子和細胞毒理學、儀器分析化學為背景，聯(lián)合動物、細胞和分子三個水平研究了鉛誘發(fā)機體氧化損傷和細胞凋亡的毒性效應及作用機理。論文主要包括以下五個部分:
　　第一章概述了鉛進入體內后吸收和分布的途徑及引發(fā)的毒性作用，介紹了氧化應激的誘發(fā)因素及與鉛毒性效應的關系，從實驗動物水平上綜述了鉛暴露誘發(fā)實驗動物產(chǎn)生氧化應激過程中抗氧化應激酶、非酶抗氧化物質、脂質過氧化水平的變化及影響因素，從細胞水平上綜

4、述了鉛暴露誘發(fā)氧化損傷與細胞凋亡及相關信號通路的相關性，最后從生物大分子水平上綜述了鉛對蛋白質、核酸等生物大分子氧化損傷的研究進展，分析了三個水平上鉛毒性評價中存在的問題，并提出了聯(lián)合動物、細胞和分子水平研究鉛誘發(fā)氧化損傷和細胞凋亡的毒性作用機理的方法。
　　第二章以斑馬魚作為研究對象，從實驗動物和生物大分子水平研究了鉛暴露誘發(fā)斑馬魚產(chǎn)生氧化應激的作用機理。本章的部分工作已經(jīng)發(fā)表在the Journal ofPhysical Ch

5、emistry B上。
　　(1)首先對斑馬魚進行了鉛暴露的急性毒性實驗，測定了24 h暴露時間內斑馬魚肝臟中抗氧化系統(tǒng)以及氧化損傷程度的影響，評價了鉛誘發(fā)的氧化應激效應。實驗結果表明，鉛暴露導致抗氧化酶CAT酶活性升高，SOD酶活性降低(CAT和SOD表達量未發(fā)生明顯變化)，谷胱甘肽相關酶GPx、GR和GST活性降低，抗氧化物質GSH/GSSG比率下降，并對細胞膜結構產(chǎn)生了氧化損傷，導致脂質過氧化物MDA含量增加。實驗結果表明鉛

6、暴露導致斑馬魚肝臟中的氧化還原平衡被打破，誘發(fā)了氧化應激效應。
　　(2)其次，選取了氧化應激過程中其關鍵保護作用的兩個抗氧化酶——CAT和SOD為靶分子，利用多種光譜學手段、等溫滴定微量熱(ITC)技術和分子對接模擬方法從分子水平上研究了鉛誘發(fā)氧化應激過程中CAT和SOD酶活性變化的微觀機理。實驗結果表明，鉛暴露引起CAT和SOD酶活性的變化趨勢在動物水平和分子水平上是一致的。由于在本實驗中鉛暴露并未引起斑馬魚肝臟中CAT和SO

7、D表達量的變化，因此兩種抗氧化酶活性變化的機理是發(fā)生了鉛與CAT及SOD的直接作用導致了酶結構的變化。具體而言，鉛通過靜電作用（ΔH＜0，ΔS＞0）與酶催化關鍵氨基酸殘基Arg141發(fā)生了直接作用，使鉛結合到SOD的活性通道內，阻礙了底物(O2-·)進入酶活性中心的路徑，破壞了SOD的骨架結構和二級結構，使活性中心的Cu2+和Zn2+釋放出來，從而導致了SOD活性的下降;鉛結合到CAT四聚體分子中最大的口袋——CAT分子的中心區(qū)域，該區(qū)

8、域遠離酶活性中心——卟啉環(huán)處，因此并沒有明顯抑制CAT酶活性。
　　第三章從細胞水平和分子水平上揭示了鉛暴露誘發(fā)DNA損傷的毒性作用機理。相關工作已經(jīng)發(fā)表在Journal of Photochemistry and Photobiology B-Biology上。
　　(1)取健康小鼠原代肝細胞，標準細胞培養(yǎng)條件下(37℃，5％CO2)進行24小時鉛暴露實驗。各暴露組細胞經(jīng)處理后，分別采用彗星實驗和DNA-蛋白質交聯(lián)實驗(D

9、PC)評價了鉛暴露誘發(fā)小鼠原代肝細胞DNA損傷的程度。實驗結果表明，暴露組中OTM值，％tail DNA及彗星尾長值等DNA損傷生物學參數(shù)均顯著增加，表明低劑量鉛暴露導致小鼠原代肝細胞中核DNA鏈發(fā)生斷裂，且DNA損傷程度呈劑量-效應關系。然而在彗星實驗的暴露劑量范圍內(1-10μMPb2+)，DPC含量并未出現(xiàn)統(tǒng)計學變化，而當暴露劑量提高到100μM時，DPC系數(shù)達到12.6％，即出現(xiàn)了明顯的DNA-蛋白質交聯(lián)現(xiàn)象，表明高劑量鉛暴露導

10、致DNA損傷嚴重，出現(xiàn)了大量的DNA片段。由于鉛離子不能自由進入肝細胞，卻影響了細胞核內DNA的正常結構和功能，表明鉛通過間接作用導致了DNA損傷。這種間接作用正是鉛暴露誘發(fā)肝細胞產(chǎn)生氧化應激效應，造成細胞內活性氧大量積累，對DNA產(chǎn)生了氧化損傷，造成了DNA鏈斷裂。
　　(2)當氧化應激程度較深時，細胞膜受到活性氧攻擊使膜通透性發(fā)生變化，此時鉛進入細胞后將會有機會與DNA分子發(fā)生直接作用。因此我們選取次甲基藍為熒光探針，利用多種

11、光譜學方法、ITC及分子對接模擬研究了鉛與DNA發(fā)生直接作用導致DNA損傷的分子機理。研究表明鉛結合到DNA分子的4個結合位點上，即通過靜電作用方式與DNA的磷酸骨架結合，并通過與DNA的嘌呤和嘧啶反應結合到DNA的小溝槽中，從而破壞了DNA的雙螺旋結構，導致DNA損傷。
　　第四章從細胞水平上評價了鉛暴露對小鼠原代肝細胞和腎細胞成活率、凋亡及氧化損傷效應的影響，并通過考察影響凋亡的信號通路ERK和激酶Caspase-3的激活情況

12、與細胞內活性氧含量的相關性，研究了鉛導致肝細胞和腎細胞凋亡的機理。另外，選取了抗凋亡相關蛋白溶菌酶(LYZ)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)為靶分子，從分子水平上研究了鉛導致體內抗氧化損傷和細胞凋亡相關蛋白的結構和功能變化的機理。本章的部分工作已經(jīng)發(fā)表在Journal ofuminescence和the Journal of Physical ChemistryB上。
　　(1)選取cell viability&death探針，利用

13、Muse細胞分析儀測定了不同鉛暴露劑量、不同染毒時間內肝細胞和腎細胞的成活率。結果表明在染毒時間為6小時和12小時的條件下，肝細胞和腎細胞成活率都呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應關系，其中腎細胞成活率對鉛暴露更加敏感，呈顯著性降低趨勢。在此基礎上，分別選取了CM-H2DCFDA和NDA為熒光探針，利用流式細胞儀和熒光顯微鏡分別測定了鉛暴露12小時后肝細胞和腎細胞中ROS和GSH含量的變化，來考察鉛暴露誘發(fā)氧化應激的程度。同時以AnnexinⅤ&7

14、-AAD為雙色細胞凋亡熒光探針，利用muse細胞分析儀測定了氧化損傷導致的肝細胞和腎細胞的凋亡情況。結果顯示GSH在肝細胞和腎細胞中均發(fā)生顯著降低，表明兩類細胞均發(fā)生了氧化應激效應。ROS在肝細胞中含量較高，表明肝細胞氧化應激程度大，但卻未引起較大程度的凋亡;而腎細胞中ROS含量保持穩(wěn)定，卻檢測到大幅度的細胞凋亡。這表明調控細胞凋亡的因素并不完全是細胞的氧化損傷程度。因此依據(jù)凋亡情況研究了凋亡相關信號通路ERK（抑制細胞凋亡）和關鍵執(zhí)行

15、分子Caspase-3（促進細胞凋亡）的激活情況及其調控機理，結果表明鉛暴露激活了肝細胞ERK通路，且激活比例與ROS產(chǎn)生量成正比，但Caspase-3僅在高濃度時被活化;腎細胞的ERK通路變化規(guī)律也同ROS含量成正比，表明ROS是調控ERK通路的信使因子。但Caspase-3激酶在腎細胞中被大幅度激活，從而導致了腎細胞的大量凋亡。在本實驗中ROS的產(chǎn)生量與ERK通路的激活比例是成正相關，表明鉛暴露下細胞發(fā)生氧化應激產(chǎn)生了過多的活性氧，

16、在活性氧刺激下基因調控了ERK信號通路的激活。而細胞自身的抗氧化防御體系（抗氧化酶，GSH等）會清除細胞內過量的ROS，盡管如此，肝細胞中ROS的凈產(chǎn)量仍然較大，從而更大比例的激活了ERK信號通路對細胞凋亡的抑制。
　　(2)選取了對細胞凋亡效應起保護作用的兩個蛋白質溶菌酶(LYZ)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)，利用多種光譜學手段、ITC技術及分子對接模擬等方法從分子水平上研究了鉛暴露對LYZ和HCG的結構和功能的影響。結果表明

17、，乙酸鉛進入了LYZ最大的活性口袋，并與位于活性口袋內部的起關鍵催化作用的氨基酸殘基(Glu35，Asp52)及具有特征熒光的氨基酸殘基（Trp62，Trp108）發(fā)生相互作用，導致LZ骨架結構和二級結構僅發(fā)生改變，從而導致了酶活性下降;在Pb-HCG的反應體系中，鉛動態(tài)地猝滅了HCG的熒光信號，其結合常數(shù)在298k，303k和310k的反應溫度下均為103M-1的數(shù)量級。ITC和分子對接模擬結果表明，乙酸鉛通過靜電作用力(ΔH＜0，Δ

18、S＞0)和疏水作用力(ΔH＞0，ΔS＞0)結合到HCG的5個作用位點上。紫外可見吸收光譜、圓二色譜及ELISA法結果表明，鉛破壞了HCG的骨架結構和二級結構，導致了HCG生物活性的下降。
　　第五章對論文的研究內容進行了歸納總結，并分析了實驗動物、原代細胞和生物大分子三個層面上聯(lián)合研究鉛導致氧化損傷的優(yōu)勢與創(chuàng)新，并展望了該研究領域未來的發(fā)展方向。本研究從分子、細胞和動物整體實驗的角度較系統(tǒng)、全面地闡明了鉛誘發(fā)機體氧化損傷和細胞凋亡