HCV核心蛋白對人Huh7肝癌細胞mRNA,lncRNA和circRNA表達的影響及其致癌機制初探.pdf

1、丙型肝炎病毒(HCV)與慢性肝炎，肝硬化和原發(fā)性肝癌(HCC)的形成密切相關。核心蛋白作為構成HCV衣殼蛋白的結構蛋白，是HCV最重要的成分之一，其參與了包括HCV的免疫逃逸，因HCV感染導致的肝纖維化和HCC等肝臟疾病和抵抗藥物治療等過程。HCC作為一種高致死率的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率持續(xù)升高，而細胞周期異常，凋亡抵抗和癌基因及相關通路的激活是其發(fā)生的主要分子機制。非編碼RNA(ncRNA)是不編碼蛋白質的RNA的總稱，其中的長非編碼

2、RNA(lncRNA)是近年來生物醫(yī)學研究的熱點內容，其參與了生物生長發(fā)育和包括HCC在內的諸多疾病發(fā)病過程。新近發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA(circRNA)由于其獨特的結構和具有的如吸附miRNA以及參與癌癥發(fā)生發(fā)展的相關信號通路等生物學功能，得到了越來越多的關注。已報道發(fā)現(xiàn)，有l(wèi)ncRNA參與到了乙型肝炎病毒(HBV)導致的肝癌中，例如HBV的HBx蛋白能下調lncRNA-Dreh從而促進腫瘤的生長和轉移。但HCV或者其核心蛋白通過調控lnc

3、RNA分子導致HCC的研究卻極為鮮見，考慮到HCV與HBV的相似性，可以推測HCV或者HCV核心蛋白導致HCC的過程中可能有l(wèi)ncRNA分子的參與。此外，circRNA在疾病診斷和治療中的具有巨大的研究與應用前景，基于以上研究背景，本研究開展了如下工作:
　　目的:
　　以HCV1b基因型核心蛋白作為研究對象，探討HCV核心蛋白對人Huh7肝癌細胞mRNA、lncRNA和circRNA表達的影響的研究，并初步分析HCV核心蛋

4、白導致的HCC致癌的相關分子機制。
　　方法:
　　構建重組表達載體PEGFP-Core（HCV核心蛋白為基因型為1b），將該重組表達載體和空載體PEGFP-C1分別轉染Huh7細胞，經G418篩選穩(wěn)定轉染細胞株并用RT-PCR檢測核心蛋白的表達。在抽提RNA后通過lncRNA芯片和環(huán)狀RNA(circRNA)芯片分析得到HCV核心蛋白表達對Huh7細胞基因表達譜的影響情況。隨后找出表達差異＞2.0的lncRNA分子和cir

5、cRNA分子，通過生物信息學分析，找出這些變化的分子與相關生理病理改變的關聯(lián)性;并同時結合閱讀文獻和利用相關分子靶位點預測平臺，挑選相關基因并給出預測的可能致癌通路，對其中的相關基因的差異表達情況進qPCR驗證，最后通過構建相關相關基因的重組表達載體并瞬時轉染Huh7-core細胞克隆，從而進一步對相關的信號通路進行探究。
　　結果:
　　LncRNA芯片包含兩個部分，其中l(wèi)ncRNA檢測部分含有30586個基因位點，mRN

6、A檢測部分含有26109個基因位點。結果顯示，與對照組相比，有4851個lncRNA表達上調和3569個lncRNA表達下調超過2倍;4785個mRNA表達上調和3192個mRNA表達下調超過對照組基因表達2倍。CircRNA芯片（含有5396個位點），分別發(fā)現(xiàn)了823個基因表達上調和419個基因表達下調超過對照組基因表達2倍。通過聚類分析和GO分析發(fā)現(xiàn)，這些分子參與了包擴細胞內大分子代謝，核酸代謝等代謝過程以及DNA損傷反應，鈣離子通

7、道調控等生化反應。通過KEGG Pathway分析，這些分子與內質網應激，凋亡，鈣離子信號途徑，Wnt信號途徑，HBV，HCV感染等信號通路存在關聯(lián)。此外經過qPCR驗證了預測的信號通路中高表達或低表達的10個相關分子。最后通過構建信號通路中的相關分子（miR122，miR192，miR204）的基因表達載體，探討了其表達對通路中其它分子可能的調控作用。
　　結論:
　　miR204-HPCAL1，HOTTIP-GLS，和C