Exosomal microRNA在前列腺癌臨床診斷中的作用.pdf

1、前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，但目前缺乏敏感性和特異性俱佳的生物標志物，尋找一種理想的腫瘤生物標志物是當前前列腺癌臨床和基礎研究中備受關注的課題。Exosomes是細胞分泌到循環(huán)血液和體液中的一類包含特定蛋白質、mRNA和microRNA(miRNA)等信號分子的小囊泡。最新研究表明，miRNA能夠被主動選擇性地包裹進Exosomes，并參與細胞間信息傳遞及通訊，其表達變化可以特異地反映機體某些生理病理狀態(tài)的動態(tài)變化和轉歸，在

2、腫瘤發(fā)生發(fā)展中有望成為良好的腫瘤特異性分子標志物，而且循環(huán)血液和體液中Exosomes的相關檢測具備無創(chuàng)、簡便等優(yōu)點。因此，體液中的Exosomal miRNA分子標志物在腫瘤臨床診斷和預后評估等方面具有良好的應用前景?；诖耍瑸榱颂接慐xosomal miRNA在前列腺癌臨床診斷中的作用，我們進行了以下三部分研究：
　　第一部分前列腺癌血清Exosomes的分離、鑒定及其生物學特性
　　目的：建立穩(wěn)定的血清Exosomes

3、分離方法并進行形態(tài)學和分子表型鑒定，探討前列腺癌Exosomes的生物學特性。
　　方法：采用ExoQuick沉淀試劑分離血清Exosomes，用透射電鏡和NanoSight分析儀，以及Western blot和流式細胞術分別進行形態(tài)學和分子表型鑒定。將來自前列腺癌患者混合血清的Exosomes與正?；|細胞WPMY-1共培養(yǎng)，用激光共聚焦顯微鏡觀察前列腺癌Exosomes在受體細胞中的轉運；分別采用CCK-8法、Transwel

4、l侵襲實驗和劃痕實驗檢測前列腺癌血清Exosomes對WPMY-1細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響。
　　結果：
　　1、血清Exosomes的提取和鑒定：采用ExoQuick從人血清中分離到的沉淀物，顆粒直徑約為30~100nm，最大分布峰值為58nm，能夠表達特征性蛋白HSP70和CD63，符合Exosomes的主要特征。
　　2、前列腺癌血清Exosomes的生物學特性：經(jīng)過24h共培養(yǎng)，激光共聚焦顯微鏡觀察到前列

5、腺癌血清 Exosomes能夠穿過細胞膜轉運到受體細胞中，且轉運量與Exosomes的初始濃度相關；前列腺癌血清Exosomes可以使正常前列腺基質細胞WPMY-1的增殖能力顯著提高，且與作用時間和Exosomes的作用濃度成正比；此外，前列腺癌Exosomes能夠促使正?；|細胞的侵襲能力和遷移能力顯著增強。
　　結論：采用ExoQuick沉淀試劑從血清中可以穩(wěn)定分離出Exosomes，前列腺癌血清Exosomes能促使正?；|

6、細胞表現(xiàn)出顯著的增殖、侵襲和遷移能力，提示其可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切，很有必要進一步探討其在腫瘤臨床診療中的價值。
　　第二部分Exosomal miRNA檢測在前列腺癌診斷中的價值
　　目的：研究Exosomes在前列腺癌循環(huán)miRNA檢測中的價值。
　　方法：采用ExoQuick沉淀試劑分離Exosomes，提取RNA，并用Agilent2200生物分析儀進行質量分析。采用qRT-PCR法檢測miRNA的相對表

7、達量。
　　結果：
　　1、Exosomal RNA的分布及其特點：Agilent2200生物分析儀檢測結果提示血清Exosomes中富含小 RNA。10例健康人群血清 Exosomes中均可檢出4種常見miRNA（miR-21，miR-16，miR-20a和let-7a），且其相對表達量顯著高于全血清樣本和去除Exosome后的上清液。
　　2、Exosomes在前列腺癌血清循環(huán)miRNA檢測中的價值：血清Exoso

8、mes中的miR-141表達水平顯著高于血清游離miR-141，且二者顯著相關，PCa組的Exosomal miR-141含量顯著高于BPH組和正常對照人群；qRT-PCR檢測51例PCa患者和40例正常對照人群的血清Exosomal miR-141表達水平，結果表明PCa組的Exosomal miR-141表達水平顯著高于正常對照組（P＜0.0001），且與腫瘤臨床病理特征有不同程度的相關性。采用Exosomal miR-141判斷轉

9、移性前列腺癌的ROC曲線下面積（AUC）為0.8694，檢測敏感性和特異性分別為80％和87.10%。
　　3、前列腺癌患者尿液Exosomal miRNA的初步檢測：在血清學研究的基礎上，我們對10例前列腺癌患者的尿液樣本進行了探索性研究。結果顯示，所有患者尿液Exosomes樣本中均可不同程度地檢出 miR-141，但總體表達水平與對照組之間未見顯著性差異（P=0.0992）。
　　結論：分離血清Exosomes有利于提

10、高某些循環(huán)miRNA的檢測敏感性，尿液Exosomes中也可以檢測到miRNA，這就為前列腺癌Exosomal miRNA標志物的研究提供了新的思路和可能性。
　　第三部分前列腺癌尿液Exosomal miRNA差異表達譜的測序篩選
　　目的：測序篩選前列腺癌患者尿液Exosomal miRNA差異表達譜。
　　方法：選取轉移性前列腺癌、局限性前列腺癌和健康男性各3例，留取晨尿。采用ExoQuick-TC沉淀試劑分離尿

11、液Exosomes，提取RNA并采用Agilent2200生物分析儀進行質檢，構建cDNA文庫，采用Illumina HiSeqTM2500平臺進行小RNA序列測定。將測序數(shù)據(jù)與miRBase21.0數(shù)據(jù)庫進行比對，計算各樣本的miRNA表達量并進行組間差異分析，篩選出前列腺癌的尿液Exosomal miRNA差異表達譜。對存在顯著性差異的基因進行qRT-PCR初步驗證。
　　結果：經(jīng)過深度測序，尿液Exosomes中miRNA的

12、平均含量為（8.10±0.03）%，各樣本間未見顯著差異。通過組間比對，發(fā)現(xiàn)Exosomal miR-375差異最為顯著，在正常對照、局限癌和轉移癌組中呈漸進性低表達，采用20例前列腺癌尿液樣本對其進行qRT-PCR初步驗證，所得結果與測序一致。此外，另有22個miRNA在前列腺癌中出現(xiàn)差異表達，其中10個呈漸進性低表達（miR-664a-5p，miR-200b-5p，miR-30a-5p， miR-30a-3p，miR-200c-3p

13、，miR-151a-3p，miR-532-5p，miR-361-3p，miR-30d-5p， miR-148-3p），12個呈漸進性高表達（miR-126-5p，miR-3656，miR-199a-5p，miR-4508，miR-9-5p，miR-1-3p，miR-126-3p，miR-199a-3p，miR-4497，miR-1273g-3p，miR-4532， miR-3960）。
　　結論：通過深度測序，初步篩選出包括miR