補腎活血湯對髕骨骨折術(shù)后的影響及MSCs遷移的分子機制的研究.pdf

1、目的:
　　結(jié)合目前最新文獻研究進展，同時通過臨床觀察補腎活血湯對“腎虛血瘀”髕骨骨折術(shù)后的臨床療效，和細胞實驗探索骨折愈合過程中MSCs遷移的分子機制，從而探討補腎活血湯促進骨折愈合的機理，為中醫(yī)藥促進骨折修復(fù)與骨重建提供新思路和藥理靶點，以此豐富“腎主骨生髓”和“活血祛瘀生新”等中醫(yī)理論。
　　方法:
　　一、文獻研究
　　歸納、總結(jié)髕骨骨折的治療進展，特別是對手術(shù)治療內(nèi)固定術(shù)的利弊點進行分析。聯(lián)系中醫(yī)藥治療

2、方法干預(yù)骨折愈合的臨床報道，分析骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)遷移與骨折愈合、補腎活血法關(guān)系，及其內(nèi)在微環(huán)境（趨化因子、信號通路）的分子機理。
　　二、臨床研究
　　隨機數(shù)字表法對60例行克氏針張力帶內(nèi)固定的老年髕骨骨折術(shù)后的患者，分為治療組和對照組。其中，治療組33例為術(shù)后連續(xù)服用補腎活血湯2周，而對照組不服用中藥，基本處理與治療組一致。利用視覺模擬法(V

3、isual Analog Scale，VAS)記錄兩組治療前后的疼痛評分，定期復(fù)查X-ray確定兩組骨折愈合時間，骨折愈合后采用Bostman評分法評估兩組的膝關(guān)節(jié)功能。
　　三、實驗研究
　　（一）、補腎活血湯提取物對大鼠BMSCs體外遷移及CCR2蛋白表達的影響
　　索氏提取法分別提取補腎活血湯石油醚部位、乙酸乙酯部位、乙醇部位和水提物。BMSCs采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)，P3代細胞用于實驗。補腎活血湯四種提取物按照1

4、0，50，100μg/mL對BMSCs進行Transwell實驗，篩選遷移活性部位。免疫蛋白印跡法(Western blot)和細胞免疫熒光檢測活性部位干預(yù)BMSCs表達CCR2蛋白量。
　　（二）、補腎活血湯活性部位對大鼠BMSCs表達Wnt5a的影響
　　Western blot檢測補腎活血湯活性部位10，50，100μg/mL濃度組的Wnt5a蛋白表達，并采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time Fluores

5、cent QuantitativePolymerase Chain Reaction，RT-qPCR)觀察各組Wnt5a mRNA表達。
　?。ㄈ?、Wnt5a基因沉默大鼠BMSCs及其遷移活性的研究
　　RT-qPCR觀察Wnt5a-RNAi慢病毒載體和陰性對照病毒轉(zhuǎn)染BMSCs后的Wnt5a mRNA表達情況，鏡下觀察各組綠色熒光表達量。Western blot檢測各組Wnt5a蛋白表達及其Transwell實驗觀察各組

6、遷移細胞數(shù)量。
　　結(jié)果:
　　一、文獻研究
　　髕骨骨折的內(nèi)固定術(shù)有其利弊，但是均能達到全面恢復(fù)髕骨功能的作用，而結(jié)合補腎活血法輔助治療，可以促進其骨折愈合。同時掌握骨折愈合過程中的分子機制規(guī)律，有利于找到促進骨折修復(fù)與骨重建的藥理靶點。而補腎活血法的治療靶點可能與募集BMSCs遷移至損傷部位相關(guān)，所涉及的趨化因子、信號通路的機制較多，而MCP-1/CCR2信號軸及其Wnt5a信號通路可能調(diào)控BMSCs遷移，著力研究

7、這兩條機制，能為補腎活血湯促進骨折愈合的研究帶來新的前景。
　　二、臨床研究
　　VAS評分:兩組在治療后的評分均較同組治療前降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）然而兩組治療后的疼痛評分結(jié)果沒有差異，差值亦沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;骨折愈合時間:治療組的骨折愈合時間較對照組的縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);Bostman評分:治療組為(28.21±1.19)，對照組為(26.22±1.15)，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)

8、意義(P＜0.01)。
　　三、實驗研究
　　補腎活血湯石油醚部位、乙酸乙酯部位、乙醇部位和水提物均能促進大鼠BMSCs體外遷移，其中石油醚部位三濃度較空白組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，以100μg/mL為最佳（P＜0.01);Western blot示補腎活血湯石油醚部位促進CCR2蛋白，與空白組比較有統(tǒng)計學(xué)差異，亦以100μg/mL濃度最佳，與細胞免疫熒光結(jié)果一致;Western blot和RT-qPCR顯示補腎活血湯石油醚部位

9、能促進大鼠BMSCs表達Wnt5a; RT-qPCR結(jié)果示三段Wnt5a-RNAi慢病毒載體有效抑制Wnt5amRNA表達，鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率約為70％，而Western blot也表明了Wnt5a-RNAi組較空白組和空載體組的Wnt5a蛋白表達有所下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，而Transwell實驗也顯示了Wnt5a-RNAi組細胞遷移數(shù)量下降。
　　結(jié)論:
　　一、補腎活血法與骨折愈合關(guān)系密切，分析其中BM