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文檔簡介
1、目的:
結合目前最新文獻研究進展,同時通過臨床觀察補腎活血湯對“腎虛血瘀”髕骨骨折術后的臨床療效,和細胞實驗探索骨折愈合過程中MSCs遷移的分子機制,從而探討補腎活血湯促進骨折愈合的機理,為中醫(yī)藥促進骨折修復與骨重建提供新思路和藥理靶點,以此豐富“腎主骨生髓”和“活血祛瘀生新”等中醫(yī)理論。
方法:
一、文獻研究
歸納、總結髕骨骨折的治療進展,特別是對手術治療內固定術的利弊點進行分析。聯系中醫(yī)藥治療
2、方法干預骨折愈合的臨床報道,分析骨髓間充質干細胞(bone marrowmesenchymal stem cells,BMSCs)遷移與骨折愈合、補腎活血法關系,及其內在微環(huán)境(趨化因子、信號通路)的分子機理。
二、臨床研究
隨機數字表法對60例行克氏針張力帶內固定的老年髕骨骨折術后的患者,分為治療組和對照組。其中,治療組33例為術后連續(xù)服用補腎活血湯2周,而對照組不服用中藥,基本處理與治療組一致。利用視覺模擬法(V
3、isual Analog Scale,VAS)記錄兩組治療前后的疼痛評分,定期復查X-ray確定兩組骨折愈合時間,骨折愈合后采用Bostman評分法評估兩組的膝關節(jié)功能。
三、實驗研究
?。ㄒ唬⒀a腎活血湯提取物對大鼠BMSCs體外遷移及CCR2蛋白表達的影響
索氏提取法分別提取補腎活血湯石油醚部位、乙酸乙酯部位、乙醇部位和水提物。BMSCs采用全骨髓貼壁法培養(yǎng),P3代細胞用于實驗。補腎活血湯四種提取物按照1
4、0,50,100μg/mL對BMSCs進行Transwell實驗,篩選遷移活性部位。免疫蛋白印跡法(Western blot)和細胞免疫熒光檢測活性部位干預BMSCs表達CCR2蛋白量。
?。ǘ?、補腎活血湯活性部位對大鼠BMSCs表達Wnt5a的影響
Western blot檢測補腎活血湯活性部位10,50,100μg/mL濃度組的Wnt5a蛋白表達,并采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time Fluores
5、cent QuantitativePolymerase Chain Reaction,RT-qPCR)觀察各組Wnt5a mRNA表達。
?。ㄈ?、Wnt5a基因沉默大鼠BMSCs及其遷移活性的研究
RT-qPCR觀察Wnt5a-RNAi慢病毒載體和陰性對照病毒轉染BMSCs后的Wnt5a mRNA表達情況,鏡下觀察各組綠色熒光表達量。Western blot檢測各組Wnt5a蛋白表達及其Transwell實驗觀察各組
6、遷移細胞數量。
結果:
一、文獻研究
髕骨骨折的內固定術有其利弊,但是均能達到全面恢復髕骨功能的作用,而結合補腎活血法輔助治療,可以促進其骨折愈合。同時掌握骨折愈合過程中的分子機制規(guī)律,有利于找到促進骨折修復與骨重建的藥理靶點。而補腎活血法的治療靶點可能與募集BMSCs遷移至損傷部位相關,所涉及的趨化因子、信號通路的機制較多,而MCP-1/CCR2信號軸及其Wnt5a信號通路可能調控BMSCs遷移,著力研究
7、這兩條機制,能為補腎活血湯促進骨折愈合的研究帶來新的前景。
二、臨床研究
VAS評分:兩組在治療后的評分均較同組治療前降低,差異有統計學意義(P<0.01)然而兩組治療后的疼痛評分結果沒有差異,差值亦沒有統計學意義(P>0.05);骨折愈合時間:治療組的骨折愈合時間較對照組的縮短,差異有統計學意義(P<0.01);Bostman評分:治療組為(28.21±1.19),對照組為(26.22±1.15),兩組差異有統計學
8、意義(P<0.01)。
三、實驗研究
補腎活血湯石油醚部位、乙酸乙酯部位、乙醇部位和水提物均能促進大鼠BMSCs體外遷移,其中石油醚部位三濃度較空白組差異均有統計學意義,以100μg/mL為最佳(P<0.01);Western blot示補腎活血湯石油醚部位促進CCR2蛋白,與空白組比較有統計學差異,亦以100μg/mL濃度最佳,與細胞免疫熒光結果一致;Western blot和RT-qPCR顯示補腎活血湯石油醚部位
9、能促進大鼠BMSCs表達Wnt5a; RT-qPCR結果示三段Wnt5a-RNAi慢病毒載體有效抑制Wnt5amRNA表達,鏡下觀察轉染效率約為70%,而Western blot也表明了Wnt5a-RNAi組較空白組和空載體組的Wnt5a蛋白表達有所下降,差異有統計學意義(P<0.001),而Transwell實驗也顯示了Wnt5a-RNAi組細胞遷移數量下降。
結論:
一、補腎活血法與骨折愈合關系密切,分析其中BM
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