補(bǔ)腎活血湯對(duì)髕骨骨折術(shù)后的影響及MSCs遷移的分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　結(jié)合目前最新文獻(xiàn)研究進(jìn)展，同時(shí)通過(guò)臨床觀察補(bǔ)腎活血湯對(duì)“腎虛血瘀”髕骨骨折術(shù)后的臨床療效，和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探索骨折愈合過(guò)程中MSCs遷移的分子機(jī)制，從而探討補(bǔ)腎活血湯促進(jìn)骨折愈合的機(jī)理，為中醫(yī)藥促進(jìn)骨折修復(fù)與骨重建提供新思路和藥理靶點(diǎn)，以此豐富“腎主骨生髓”和“活血祛瘀生新”等中醫(yī)理論。
　　方法:
　　一、文獻(xiàn)研究
　　歸納、總結(jié)髕骨骨折的治療進(jìn)展，特別是對(duì)手術(shù)治療內(nèi)固定術(shù)的利弊點(diǎn)進(jìn)行分析。聯(lián)系中醫(yī)藥治療

2、方法干預(yù)骨折愈合的臨床報(bào)道，分析骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)遷移與骨折愈合、補(bǔ)腎活血法關(guān)系，及其內(nèi)在微環(huán)境（趨化因子、信號(hào)通路）的分子機(jī)理。
　　二、臨床研究
　　隨機(jī)數(shù)字表法對(duì)60例行克氏針張力帶內(nèi)固定的老年髕骨骨折術(shù)后的患者，分為治療組和對(duì)照組。其中，治療組33例為術(shù)后連續(xù)服用補(bǔ)腎活血湯2周，而對(duì)照組不服用中藥，基本處理與治療組一致。利用視覺(jué)模擬法(V

3、isual Analog Scale，VAS)記錄兩組治療前后的疼痛評(píng)分，定期復(fù)查X-ray確定兩組骨折愈合時(shí)間，骨折愈合后采用Bostman評(píng)分法評(píng)估兩組的膝關(guān)節(jié)功能。
　　三、實(shí)驗(yàn)研究
　?。ㄒ唬⒀a(bǔ)腎活血湯提取物對(duì)大鼠BMSCs體外遷移及CCR2蛋白表達(dá)的影響
　　索氏提取法分別提取補(bǔ)腎活血湯石油醚部位、乙酸乙酯部位、乙醇部位和水提物。BMSCs采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)，P3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。補(bǔ)腎活血湯四種提取物按照1

4、0，50，100μg/mL對(duì)BMSCs進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)，篩選遷移活性部位。免疫蛋白印跡法(Western blot)和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)活性部位干預(yù)BMSCs表達(dá)CCR2蛋白量。
　?。ǘ?、補(bǔ)腎活血湯活性部位對(duì)大鼠BMSCs表達(dá)Wnt5a的影響
　　Western blot檢測(cè)補(bǔ)腎活血湯活性部位10，50，100μg/mL濃度組的Wnt5a蛋白表達(dá)，并采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time Fluores

5、cent QuantitativePolymerase Chain Reaction，RT-qPCR)觀察各組Wnt5a mRNA表達(dá)。
　　（三）、Wnt5a基因沉默大鼠BMSCs及其遷移活性的研究
　　RT-qPCR觀察Wnt5a-RNAi慢病毒載體和陰性對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染BMSCs后的Wnt5a mRNA表達(dá)情況，鏡下觀察各組綠色熒光表達(dá)量。Western blot檢測(cè)各組Wnt5a蛋白表達(dá)及其Transwell實(shí)驗(yàn)觀察各組

6、遷移細(xì)胞數(shù)量。
　　結(jié)果:
　　一、文獻(xiàn)研究
　　髕骨骨折的內(nèi)固定術(shù)有其利弊，但是均能達(dá)到全面恢復(fù)髕骨功能的作用，而結(jié)合補(bǔ)腎活血法輔助治療，可以促進(jìn)其骨折愈合。同時(shí)掌握骨折愈合過(guò)程中的分子機(jī)制規(guī)律，有利于找到促進(jìn)骨折修復(fù)與骨重建的藥理靶點(diǎn)。而補(bǔ)腎活血法的治療靶點(diǎn)可能與募集BMSCs遷移至損傷部位相關(guān)，所涉及的趨化因子、信號(hào)通路的機(jī)制較多，而MCP-1/CCR2信號(hào)軸及其Wnt5a信號(hào)通路可能調(diào)控BMSCs遷移，著力研究

7、這兩條機(jī)制，能為補(bǔ)腎活血湯促進(jìn)骨折愈合的研究帶來(lái)新的前景。
　　二、臨床研究
　　VAS評(píng)分:兩組在治療后的評(píng)分均較同組治療前降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）然而兩組治療后的疼痛評(píng)分結(jié)果沒(méi)有差異，差值亦沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;骨折愈合時(shí)間:治療組的骨折愈合時(shí)間較對(duì)照組的縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);Bostman評(píng)分:治療組為(28.21±1.19)，對(duì)照組為(26.22±1.15)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

8、意義(P＜0.01)。
　　三、實(shí)驗(yàn)研究
　　補(bǔ)腎活血湯石油醚部位、乙酸乙酯部位、乙醇部位和水提物均能促進(jìn)大鼠BMSCs體外遷移，其中石油醚部位三濃度較空白組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以100μg/mL為最佳（P＜0.01);Western blot示補(bǔ)腎活血湯石油醚部位促進(jìn)CCR2蛋白，與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，亦以100μg/mL濃度最佳，與細(xì)胞免疫熒光結(jié)果一致;Western blot和RT-qPCR顯示補(bǔ)腎活血湯石油醚部位

9、能促進(jìn)大鼠BMSCs表達(dá)Wnt5a; RT-qPCR結(jié)果示三段Wnt5a-RNAi慢病毒載體有效抑制Wnt5amRNA表達(dá)，鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率約為70％，而Western blot也表明了Wnt5a-RNAi組較空白組和空載體組的Wnt5a蛋白表達(dá)有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，而Transwell實(shí)驗(yàn)也顯示了Wnt5a-RNAi組細(xì)胞遷移數(shù)量下降。
　　結(jié)論:
　　一、補(bǔ)腎活血法與骨折愈合關(guān)系密切，分析其中BM