臍血微囊泡促進人乳腺上皮細胞HBL-100分泌乳蛋白.pdf

1、背景：母嬰間的微囊泡（Mcrovesicles，MV）通訊機制，越來越受到人們的關注。臍血是母嬰間通訊的紐帶，在妊娠過程中，臍血微囊泡可以調節(jié)母體免疫系統(tǒng)、促進胚胎發(fā)育和器官發(fā)育等。miRNA是一類轉錄后調節(jié)基因表達的非編碼RNA，是微囊泡通訊機制中重要的信息分子。微囊泡將miRNA傳遞給受體細胞，改變受體細胞的功能，從而發(fā)揮細胞間“信使”的作用。研究表明，miRNA具有調節(jié)乳腺上皮細胞，促進泌乳的作用。let-7g和miR-221可調

2、控乳腺上皮細胞的增殖及β-酪蛋白的分泌，miRNA-142-3p通過靶向調控泌乳素受體PRLR的表達，影響下游信號通路的變化，從而影響乳腺上皮細胞酪蛋白的合成與分泌。本文從健康足月產婦新生兒臍血中分離微囊泡，通過對其結構、與泌乳相關miRNA表達譜和生物信息學分析，以及微囊泡影響人乳腺上皮細胞HBL-100分泌酪蛋白的實驗驗證，證實存在促進泌乳的臍血微囊泡通訊機制。有望揭示臍血微囊泡調控泌乳的現象及其相關機制，為母嬰間信息通訊提供新的思

3、路。
　　目的：⑴明確臍血微囊泡結構及其miRNA特征。⑵驗證促進泌乳的臍血微囊泡通訊方式。⑶促進人乳腺上皮細胞分泌乳蛋白臍血微囊泡通訊機制。
　　方法：①經重慶醫(yī)科大學倫理委員會批準及患者本人知情同意，收集臍血標本70例。所有患者臨床資料完整。胎盤娩出后，用臍血袋立即無菌采集新生兒臍血100 ml，6小時內提取囊泡。②用差速離心法提取臍血微囊泡，透射顯微鏡觀察臍血微囊泡的形態(tài)，WB鑒定其表面分子CD63，激光粒度儀和納米顆

4、粒跟蹤分析儀對臍血微囊泡進行尺度分析。RNA毛細血管電泳定性定量分析臍血微囊泡的總RNA。③通過文獻挖掘、數據庫搜索和同源序列分析獲得人泌乳相關miRNA，用ClueGO軟件對miRNA的靶基因進行GO分析和KEGG pathway分析，用Cytoscape軟件構建miRNA-靶基因的網絡圖。用高通量PCR分析臍血微囊泡miRNA表達譜。④用FITC標記的微囊泡與人乳腺上皮細胞HBL-100共培養(yǎng)。共聚焦顯微鏡觀察臍血微囊泡與人乳腺上皮

5、細胞HBL-100相互作用的方式，ELISA法檢測乳腺上皮細胞培養(yǎng)上清中酪蛋白的含量，RT-PCR和WB檢測泌乳相關重要基因PRLR、STAT5、Akt和mTOR的mRNA和蛋白的表達。
　　結果：⑴采用12000g的離心力從健康足月產婦新生兒臍血中分離出平均直徑167.0±77.1nm的圓形或類圓形小體，表達膜表面抗原分子CD63。RNA毛細血管電泳顯示，在20nt處有峰值，表明臍血微囊泡內含有miRNA。⑵通過文獻挖掘和數據庫

6、搜索，得到112條在小鼠、大鼠、牛、山羊、綿羊等動物泌乳期差異表達的miRNA，其中83條miRNA上調表達，29條miRNA下調表達。使用BLAST同源序列分析發(fā)現，上調的miRNA中有51條miRNA與人類miRNA高度同源（E-value<6.00 E-04）,有18條下調的miRNA與人類miRNA高度同源（E-value<6.00 E-04）；使用靶基因預測工具預測miRNA的靶基因，結果顯示，上調表達的miRNA一共預測到1

7、129個靶基因，下調表達的miRNA一共預測得到835個靶基因；通過對差異表達的miRNA的靶基因進行GO分析，發(fā)現其靶基因參與的細胞生物學功能包括大分子生物合成與代謝、細胞代謝、神經系統(tǒng)發(fā)育、RNA合成與代謝、基因表達和轉錄調控等；進一步對這些差異表達的miRNA的靶基因進行Pathway分析。發(fā)現其靶基因參與的信號通路廣泛，其中包括 MAPK信號通路、腫瘤microRNA信號通路、mTOR信號通路、甲狀腺信號通路、干細胞多能性信號通

8、路、PI3K-Akt信號通路和TGF-β信號通路等；使用Cytoscape軟件構建miRNA-靶基因網絡圖。結果顯示， miRNA靶向調控主要由miRNA-30a， miRNA-23a， miRNA-27a， miRNA-15b， miRNA-16， miRNA-29，miRNA-22，miRNA-106a這8個miRNA參與了乳蛋白重要相關基因PRLR、STAT5、Akt和mTOR的調控。經miRNA高通量PCR分析，共表達337個m

9、iRNA，包含let-7g、miR-221、miRNA-142-3p、miR-101a、miR-122、miR-132和 miR-27a的表達。55個泌乳相關miRNA，占臍血微囊泡總的miRNA的25.22％。選取其中26個差異表達最顯著的miRNA做qPCR驗證。平均CT值穩(wěn)定表達在20-30。⑶臍血微囊泡（30μl）與人乳腺上皮細胞HBL-100((1×105個/孔)共培養(yǎng)，隨著時間的增加培養(yǎng)液上清中酪蛋白（CSN2）的水平呈升高

10、趨勢，在共培養(yǎng)96小時，CSN2的濃度達16ng/ml，與對照組比較，有顯著差異（P<0.05）。將FITC標記的臍血微囊泡加入到人乳腺上皮細胞HBL-100培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)4h后，觀察到HBL-100細胞內呈現綠色FITC熒光。與臍血微囊泡共培養(yǎng)48h后，觀察人乳腺上皮細胞HBL-100中PRLR、EGFR、STAT5、Akt、mTOR mRNA的表達，其中PRLR mRNA表達水平與對照組相比顯著升高（P<0.05），其余基因的mR

11、NA表達與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。Western blotting結果顯示微囊泡共培養(yǎng)組，HBL-100表達PRLR、STAT5蛋白質水平顯著高于對照組（P<0.05）。
　　結論：①采用12000g的離心力，發(fā)現人臍血中存在平均直徑167.0±77.1nm的微囊泡，表達膜表面抗原CD63分子。含有大量miRNA。②臍血微囊泡包含泌乳相關miRNA，與人乳腺上皮細胞HBL-100的結合進入細胞內，促進細胞體外分泌乳蛋