MAPK-COX路徑在GnRH調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞PGE2表達中的作用.pdf

1、動物的繁殖機能主要是受促性腺激素釋放激素神經(jīng)元（gonadotropin-releasing hormone neurons,GnRH neurons）調(diào)控，GnRH神經(jīng)元合成分泌的GnRH以脈沖的方式從正中隆起釋放進入垂體門脈系統(tǒng)，到達腺垂體并特異性地與促性腺細胞上的受體結合，刺激腺垂體合成和分泌LH、FSH，最終調(diào)節(jié)動物的生殖行為。星形膠質(zhì)細胞（astrocytes,AST）是一種特殊的膠質(zhì)細胞，連續(xù)地分布于整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)，執(zhí)行著

2、復雜的功能。近年來，隨著學者們對星形膠質(zhì)細胞的深入研究發(fā)現(xiàn)，除了GnRH神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細胞分泌的膠質(zhì)因子PGE2能夠通過調(diào)節(jié)GnRH神經(jīng)元的活性和分泌來間接調(diào)節(jié)動物的繁殖。然而，GnRH神經(jīng)元分泌的GnRH能否反饋調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞仍沒有報道。本實驗利用體外培養(yǎng)的大鼠下丘腦星形膠質(zhì)細胞，探究GnRH對星形膠質(zhì)細胞分泌PGE2的調(diào)控機制。
　　其主要目標為：
　?。?）探究星形膠質(zhì)細胞上是否存在GnRHR；
　?。?）在

3、體外條件下，GnRH是否影響培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞中PGE2的表達；
　?。?）COX在GnRH調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞分泌PGE2中的作用；
　?。?）MAPK信號通路是否參與GnRH對星形膠質(zhì)細胞PGE2表達的調(diào)節(jié)。為了有效研究GnRH對體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞PGE2表達的影響，研究如下：
　?。?）實驗選取1–3日齡的SD新生大鼠，分離下丘腦進行原代和傳代培養(yǎng)，并多次純化達到純化率為99％以上的星形膠質(zhì)細胞，為后續(xù)研究提供了大量

4、高純度、符合要求的細胞。
　　（2）為了探究星形膠質(zhì)細胞上是否存在GnRHR，實驗利用免疫熒光、基因測序及Western Blot方法檢測星形膠質(zhì)細胞上是否存在GnRHR，結果顯示星形膠質(zhì)細胞上存在GnRHR，為后續(xù)研究奠定基礎。
　?。?）為了探究GnRH對培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞中PGE2表達的影響，實驗選取10-12 mol/L、10-10 mol/L、10-8 mol/L、10-6 mol/L的GnRH刺激體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)

5、細胞，分別在1 h、6 h、12h、24 h、48 h通過ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中PGE2的表達量。結果顯示，12 h時10-10 mol/L GnRH處理組與對照組相比PGE2的表達量升高，且差異顯著（P<0.05）；10-8 mol/L和10-6 mol/L的GnRH處理組與對照組相比PGE2的表達量減少，且差異顯著（P<0.05）。
　　（4）為了探究COX在GnRH調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞分泌PGE2中的作用，實驗選取10-10

6、 mol/L GnRH刺激細胞，通過熒光定量PCR、ELISA和 WesternBlot檢測在1 h、6 h、12 h、24 h、48 h時COX-1和COX-2的mRNA和蛋白的表達水平。結果顯示，COX-1 mRNA的表達量在12 h時增加，COX-2 mRNA的表達量在6 h和12 h時顯著增加，與COX-1相比上調(diào)量更大；通過ELISA和Western Blot檢測結果發(fā)現(xiàn)，12 h后COX-1和COX-2的表達量均上調(diào)，且CO

7、X-2比 COX-1上調(diào)幅度更大，表明COX-2與COX-1相比起更主要的作用。
　　為了驗證GnRH刺激星形膠質(zhì)細胞后是否通過上調(diào)COX-1和COX-2而引起PGE2的表達升高，分別用50 nmol/L SC-560和3μmol/L NS-398預處理星形膠質(zhì)細胞后，通過ELISA檢測上清中PGE2含量。結果顯示，GnRH+SC-560組和GnRH+NS-398組對GnRH誘導星形膠質(zhì)細胞分泌的PGE2均有抑制作用，而且NS-3

8、98對細胞分泌PGE2的抑制作用更強。表明COX-1和COX-2對GnRH誘導星形膠質(zhì)細胞分泌的PGE2均有影響，而且COX-2起更主要的作用。
　　（5）為了研究p38、JNK、ERK三條經(jīng)典的MAPK信號通路在GnRH調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞分泌PGE2中的作用，實驗選取20μmol/L p38抑制劑SB203580、10μmol/L JNK抑制劑 SP600125、10μmol/LERK抑制劑U0126預處理星形膠質(zhì)細胞后分別加入1

9、0-10 mol/L GnRH預處理星形膠質(zhì)細胞12 h，通過ELISA檢測上清中PGE2的含量。結果顯示，三種抑制劑均能夠抑制GnRH上調(diào)的PGE2，且U0126的抑制效果最明顯，表明p38、JNK、ERK信號通路對GnRH誘導星形膠質(zhì)細胞分泌PGE2的過程具調(diào)控作用，其中ERK信號通路對其調(diào)控作用最明顯。
　　MAPK通路抑制劑處理星形膠質(zhì)細胞后，通過熒光定量PCR和Western Blot檢測COX-1和COX-2的表達水平

10、。結果顯示，SB203580和U0126能夠下調(diào)COX-1的mRNA和蛋白的表達，SP600125對星形膠質(zhì)細胞COX-1無影響；SB203580、SP600125和U0126處理星形膠質(zhì)細胞后均能顯著下調(diào)COX-2的mRNA和蛋白的表達水平，其中U0126的抑制效果最明顯。該結果結合上述PGE2的表達變化表明，GnRH通過p38/ERK-COX-1和p38/JNK/ERK-COX-2信號通路促進星形膠質(zhì)細胞PGE2的產(chǎn)生，且p38/J

11、NK/ERK-COX-2途徑在產(chǎn)生PGE2的過程中起更重要的作用。
　　綜上所述，該實驗可以得到以下結論：
　?。?）體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞能夠表達GnRHR，為研究GnRH調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞功能奠定了形態(tài)學依據(jù)。
　?。?）GnRH影響星形膠質(zhì)細胞PGE2的表達，較高濃度（10-8 mol/L、10-6 mol/L）時抑制細胞PGE2的產(chǎn)生，較低濃度（10-10 mol/L）時對PGE2的表達具顯著促進作用。