MiR-107通過下調(diào)SIAH1的表達影響乳腺癌細胞的生物學(xué)行為.pdf

1、目的：
　　本研究結(jié)果表明乳腺癌細胞中miR-107下調(diào)SIAH1的表達。乳腺癌細胞中過表達miR-107可致使SIAH1表達減少，促進細胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲并且能抑制細胞凋亡。相反，當我們在乳腺癌細胞中沉默miR-107的表達可導(dǎo)致SIAH1表達增加，降低三陰乳腺癌細胞在體內(nèi)外的致瘤性。
　　材料與方法：
　　1、倫理學(xué)聲明
　　動物實驗嚴格遵守赫爾辛基宣言的道德標準和國家、國際準則進行，并已獲得中國醫(yī)

2、科大學(xué)倫理審查委員會準許。
　　2、乳腺癌組織
　　本研究采用了38對原發(fā)性乳腺癌組織和其相應(yīng)的癌旁非腫瘤組織，均來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2013年1月至12月乳腺癌外科手術(shù)切除標本。所有患者術(shù)前均未接收放、化療，且均已簽署知情同意書。收集的乳腺癌組織立即儲存在-80℃冰箱中備用。
　　3、細胞培養(yǎng)
　　人乳腺癌細胞MCF-7和乳腺正常上皮細胞MCF-10A培養(yǎng)在含10％胎牛血清和1％青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)

3、基中;三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231培養(yǎng)在10％胎牛血清和1％青-鏈霉素的L-15培養(yǎng)基中。三種細胞均培養(yǎng)在37℃、5％CO2的孵箱中。
　　4、qRT-PCR
　　用RNAiso（TaKaRa公司）從人乳腺癌組織和細胞中提取總RNA。One StepPrimeScript(R)miRNA cDNA合成試劑盒(TaKaRa)合成cDNA。SYBR(R)Premix ExTaqTMⅡ(TaKaRa)檢測miR-107的表

4、達情況（使用Applied Biosystems7900HTFast Real-Time PCR系統(tǒng)）。以RNU6b標準化使用ΔΔCT方法量化miR-107的表達。MiR-107和RNU6b的特異性PCR引物分別由Invitrogen和TaKaRa公司合成。RNU6b為內(nèi)參對照。以配對癌旁乳腺組織中miR-107的表達水平作為基準(=1)。
　　5、Westem Blot
　　用含有1mM PMSF的RIPA裂解緩沖液從人乳

5、腺癌組織和細胞中提取額總蛋白，然后電泳（10％ SDS-PAGE分離），并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉2小時，分別孵育特異性一抗SIAH1（Santa Cruz Biotechnology公司）、β-actin(ZSGB-Bio公司)，4℃過夜，分別孵育相應(yīng)二抗2小時， ECL（賽默飛世爾科技）顯示。結(jié)果經(jīng)自動凝膠成像分析儀采集，進行灰度值測定。
　　6、試劑
　　MIR-107 mimics、miR-107 inhibitor、

6、miR-107 antagomir及NC miR-mimics、NC miR-inhibitor、NC miR-antagomir由上海吉瑪生物技術(shù)有限公司合成。SIAH1表達載體(pcDNA3-myc-SIAH1)由Dr Matsuzawa Shu-ichi[13，14](Burnham Institute，La Jolla, CA，USA)友情贈送。 SIAH1 siRNA廣州市銳博生物技術(shù)公司設(shè)計并合成。細胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofec

7、tamine2000(Invitrogen)根據(jù)制造商的說明書使用。
　　7、雙熒光素酶報告基因檢測
　　野生型或突變體SIAH1-3'UTR熒光素酶報告載體由上海GeneChem有限公司設(shè)計并合成。MCF-7細胞接種于96孔板24小時，轉(zhuǎn)染前達80％匯合度。將600ng野生型或突變型SIAH1-3'UTR螢光素酶報告基因載體、40 pmol miR-107mimics或NC miR-mimics和10 ng pRL-TK載

8、體（含有海腎熒光素基因）共轉(zhuǎn)染到MCF-7細胞。轉(zhuǎn)染24小時后使用Dual-Luciferase(R)Reporter Assay System(Promega)檢測螢火蟲和海腎螢光素酶活性。以海腎螢光素酶活性標準化螢火蟲螢光素酶活性以控制轉(zhuǎn)染效率。
　　8、MTT法檢測細胞增殖
　　轉(zhuǎn)染后24小時將單細胞懸液接種在96孔板（每孔3×103個細胞）。每孔加MTT避光孵育4小時，加入DMSO，用酶標儀測定570nm波長下的吸光

9、度值，每天一次共檢測四次。繪制細胞增殖曲線。
　　9、集落形成實驗
　　轉(zhuǎn)染后24小時，將細胞接種于培養(yǎng)皿中，在含10％胎牛血清的DMEM或L15培養(yǎng)基中培養(yǎng)直至形成肉眼可見的菌落。用預(yù)冷甲醇固定細胞集落，蘇木素染色，洗滌并空氣干燥。
　　10、流式細胞術(shù)分析細胞周期和凋亡
　　使用流式細胞儀進行細胞周期分析，轉(zhuǎn)染后48小時收集1×106個細胞固定在500μl70％冷乙醇中4℃過夜。離心收集固定細胞加入100μ1

10、 RNaseA37℃水浴30分鐘，然后加入400μl碘化丙啶混勻（凱基生物科技有限公司），4℃放置30分鐘內(nèi)上機檢測。
　　轉(zhuǎn)染48小時后收集1～5×105細胞使用AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。
　　11、細胞遷移和侵襲實驗
　　細胞遷移實驗中，在transwell小室下室加入600μ1含20％胎牛血清的DMEM或L15培養(yǎng)基，上室加入100μ1含有2％胎牛血清DMEM或L15培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后24

11、小時將3×104個MCF-7或MDA-MB-231細胞接種到上室。37℃、5％CO2的孵箱中孵育24小時后，除去培養(yǎng)基，PBS清洗后預(yù)冷甲醇固定15分鐘，用棉簽擦掉微孔膜上表面的細胞，蘇木素染色，室溫干燥。取下微孔膜置于載玻片上顯微鏡下計數(shù)細胞。
　　細胞侵襲實驗中，在transwell小室上室預(yù)涂一層稀釋的Matrigel(BD，Matrigel:MEM=1∶3)置于37℃、5％CO2孵箱中凝固。轉(zhuǎn)染后24小時將1×105個MC

12、F-7或MDA-MB-231細胞接種到上室。其他實驗步驟同細胞遷移實驗一致。
　　12、動物實驗
　　BALB/c無胸腺裸鼠從上海SLAC實驗動物有限公司購買，養(yǎng)殖于中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，條件達SPF級。1×107個MDA-MB-231單細胞懸浮接種到裸鼠右側(cè)腋窩的皮下組織中，建立三陰乳腺癌移植瘤模型。接種2周后，裸鼠被隨機分成兩組(n=6)。每只裸鼠按照10 nmolNC miR-antagomir或miR-107an

13、tagomir直接注射到移植瘤內(nèi)，瘤內(nèi)多點注射，每四天一次共六次。使用游標卡尺測定并計算得出移植瘤體積V=(L×W2)×0.5。
　　13、免疫組化
　　裸鼠移植瘤組織固定在4％多聚甲醛中，石蠟包埋和切片。多克隆山羊抗SIAH1抗體和多克隆小鼠抗i67抗體4℃孵育過夜。結(jié)果判定:SIAH1以細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顯色，Ki67以細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顯色。
　　14、統(tǒng)計分析
　　Pearson相關(guān)檢

14、測方法分析miR-107和SIAH1之間的相關(guān)性。組間差異采用t檢驗統(tǒng)計分析。P＜0.05被認為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、miR-107在乳腺癌組織和細胞中表達增加，且與SIAH1的表達顯著負相關(guān)
　　乳腺癌組織中miR-107的表達顯著高于癌旁乳腺組織。而SIAH1在乳腺癌組織中的表達明顯低于癌旁乳腺組織。Pearson相關(guān)分析顯示miR-107和SIAH1的表達之間存在顯著負相關(guān)性。對比人正常乳腺上皮細胞

15、MCF-10A，在人乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231中miR-107的表達顯著增加，而SIAH1的表達則明顯下降。
　　2、SIAH1是miR-107的一個下游靶點
　　過表達miR-107時僅在MCF-7細胞中發(fā)現(xiàn)SIAH1表達顯著減少，MDA-MB-231細胞中SIAH1的表達改變不明顯;但是抑制miR-107表達時，在兩種乳腺癌細胞中均發(fā)現(xiàn)SIAH1表達明顯增加。雙熒光色素酶報告基因測試發(fā)現(xiàn)當共轉(zhuǎn)染miR-

16、107mimics和野生型SIAH13'-UTR的報告基因載體時，熒光素酶活性降低;而當共轉(zhuǎn)染miR-107 mimics和突變型SIAH13'-UTR的報告基因載體時，熒光素酶活性沒有變化。因此我們認為miR-107通過與SIAH13'-UTR預(yù)測的結(jié)合位點直接結(jié)合來下調(diào)SIAH1的表達。
　　3、miR-107通過抑制SIAH1的表達，促進乳腺癌細胞增殖、克隆形成和細胞周期進程
　　在MCF-7細胞中過表達miR-107

17、時可顯著促進細胞的增殖和集落的形成;與此相反，在MCF-7和MDA-MB-231細胞中沉默miR-107表達時能明顯抑制細胞的增殖和集落的形成。然而，當SIAH1的表達幾乎恢復(fù)到對照組細胞水平時，細胞增殖和集落形成也幾乎恢復(fù)到對照組細胞水平。
　　過表達miR-107時細胞周期S期細胞所占百分比增加，而G1期細胞的百分比減少。與此相反，抑制miR-107表達時降低S期細胞的百分比而增加G1期細胞的百分比。然而，當SIAH1的表達幾

18、乎恢復(fù)到對照組細胞水平時，S期和G1期的百分比也幾乎恢復(fù)到對照組細胞水平。
　　結(jié)論：
　　1、miR-107在乳腺癌組織和細胞中表達增加，且與SIAH1的表達顯著負相關(guān)
　　2、SIAH1是miR-107的一個下游靶點
　　3、miR-107通過抑制SIAH1的表達，促進乳腺癌細胞增殖、克隆形成和細胞周期進程
　　4、miR-107通過下調(diào)SIAH1的表達，抑制乳腺癌細胞凋亡且促進其遷移和侵襲