串聯(lián)親和純化技術聯(lián)合質譜鑒定RSK4及其變異體的相互作用蛋白.pdf

1、背景:p90核糖體S6蛋白激酶4(Ribosomal S6 protein kinase4，RSK4)是一新發(fā)現(xiàn)的抑制乳腺癌侵襲轉移的重要因子，它能抑制乳腺癌細胞的生長并誘導其衰老;而RSK4前體mRNA在可變剪切作用下形成可變剪接的變異體(RSK4m)，并具有不同的生物學功能。迄今為止，RSK4及其變異體RSK4m在乳腺癌中作用機制所知甚少。蛋白質是生命活動的主要物質，蛋白質功能的實現(xiàn)，離不開與其它蛋白質之間的相互作用?？勺兗艚邮钦{節(jié)

2、基因表達和產生蛋白質多樣性的重要機制。前期研究我們認為RSK4及其變異體與其它蛋白通過相互作用形成不同的蛋白質復合物后在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。
　　目的：本研究擬建立哺乳動物體系中的串聯(lián)親和純化技術，并聯(lián)合質譜分析鑒定RSK4及其變異體相互作用蛋白質，經生物信息學方法分析找尋RSK4及其變異體相互作用蛋白中可能存在的關鍵蛋白，初步驗證其生物學功能。本研究通過對RSK4和其變異體RSK4m的相互作用蛋白的研究，可以為我們初

3、步了解其獨特的蛋白功能和作用機制，從而為進一步闡明乳腺癌發(fā)生發(fā)展機制及尋找乳腺癌治療新靶點開辟新思路和新途徑。
　　方法:分別構建了帶有串聯(lián)親和標簽（兩個strepⅡ標簽和一個FLAG標簽）的RSK4和RSK4m過表達載體。轉染到RSK4低表達的乳腺癌細胞株MDA-MB-231中，運用串聯(lián)親和純化技術(tandem affinity purification，TAP)，得到與RSK4或RSK4m相互作用的蛋白復合物，然后對所得的蛋

4、白復合物進行質譜鑒定和分析，應用生物信息學分析方法（GO和IPA分析），分別對RSK4和RSK4m的相互作用蛋白進行功能注釋和繪制了蛋白-蛋白相互作用網絡圖。為了確認生物信息學分析結果，我們還利用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，CO-IP)對其中PRMT5（蛋白精氨酸甲基轉移酶5）蛋白與RSK4的相互作用關系進行驗證。
　　研究結果:本研究通過兩個StrepⅡ標簽和單個FLAG標簽為基礎的串聯(lián)親和純化技術

5、（SF-TAP）聯(lián)合運用nano LC-MS/MS質譜技術分別分離和鑒定出82個RSK4相關的相互作用蛋白，137個RSK4m相關的相互作用蛋白。應用生物信息學分析方法（GO和IPA分析），分別對RSK4和RSK4m的相互作用蛋白進行功能注釋和繪制了蛋白-蛋白相互作用網絡圖。 GO(Gene Ontology)分析結果: RSK4 wt或RSK4m的互作蛋白參與細胞的多種生理活動，比如:tRNA代謝(tRNA metabolic pro

6、cess)，核糖體蛋白復合物的生物合成(ribonucleoprotein complex biogenesis)，氨基酸的活化(amino acid activation)和蛋白折疊(protein folding)等，這些互作蛋白絕大部分都位于細胞質中，與RSK4本身位于細胞質，在細胞質發(fā)揮生物功能是一致的。IPA（Ingenuity Pathway Analysis）分析結果:將鑒定到的互作蛋白經過核心數(shù)據(jù)分析方法(Core An

7、alyze dateset)，分別得到RSK4 wt和RSK4m各自三個富集度最高的信號通路和蛋白互作網絡:①RSK4 wt和RSK4m主要參與了核糖體生物合成，互作蛋白組網絡中的PRMT5、STAT3、HSP90AB1、ATP5B、RPL核糖體亞基系列蛋白等與細胞中核糖體生物合成密切相關;②RSK4 wt和RSK4m的互作蛋白均參與細胞前體RNA的處理，互作蛋白中的HNRNPH1、HNRNPK、HNRNPM屬于hnRNPs(heter

8、ogeneousnuclear ribonucleproteins)家族，是RNA結合蛋白，能與mRNA前體相互作用，影響mRNA前體的處理以及mRNA代謝和運輸;③RSK4 wt和RSK4m主要參與染色體的重組與代謝，相互作用蛋白STK38、STK38L、MOB2和DDX3X參與調節(jié)中心體的復制和有絲分裂期染色質的重組。綜合GO分析和IPA分析的結果，表明RSK4 wt和RSK4m參與了多種細胞活動，擁有多種不同的生物學功能。RSK4

9、m的相互作用蛋白更多，并且參與更多的生物通路。同時，CO-IP證實了其中的蛋白如PRMT5與RSK4存在相互作用關系，表明PRMT5可能可以通過甲基化RSK4從而抑制RSK4對細胞生長的抑制作用。
　　結論:RSK4和RSK4m存在與其相互作用蛋白，相互作用蛋白復合物主要參與了核糖體生物合成、前體RNA處理和染色體的重組與代謝，并介導多種生物學功能調控，特別是有關細胞衰老的調控;而且RSK4和RSK4m有著不同相互作用蛋白，其調控