蛋白質內含子體內定向進化和切割、分段表達及體外剪接.pdf

1、蛋白質內含子是位于蛋白質前體內的插入序列，其兩側的氨基酸序列稱為蛋白質外顯子。在蛋白質前體翻譯后成熟過程中，蛋白質內含子通過四個連續(xù)的親核置換反應精確地從前體蛋白質中自我切除，同時催化兩側蛋白質外顯子以肽鍵相連產生成熟蛋白，這一過程稱為蛋白質剪接。蛋白質內含子自主催化的反應為蛋白質合成和加工提供了新的途徑，因而在蛋白質工程及其它領域具有廣泛的應用前景。
　　 但是，在目前的研究中，仍然存在著大量未解決的問題，如異源生物體內剪接效

2、率低、蛋白質內含子純化系統(tǒng)效率低以及不能實現(xiàn)蛋白質剪接人為控制等。針對以上問題，本研究對蛋白質內含子進行了如下改造：
　　 將卡那霉素抗性和蛋白質剪接活性相結合，成功的在異源生物體內構建了依賴卡那霉素抗性的蛋白質內含子篩選系統(tǒng)。選擇TerThyX和Ssp DnaX兩個微小蛋白質內含子對該篩選系統(tǒng)的可行性進行檢驗，結果顯示：含有卡那霉素的平板上的菌落生長情況與western blot檢測結果一致，證明本篩選系統(tǒng)完全可行。進一步結合

3、定向進化的策略，利用易錯PCR，構建菌落數(shù)超過106的突變庫，在抗性平板上獲得了4個高剪接活性的突變蛋白質內含子。Westernblot顯示：改造后的Ssp DnaX微小蛋白質內含子在E.coli細胞內剪接活性高于90％，真正解決了異源生物體內剪接活性低的問題。
　　 利用已獲得的高剪接活性的S1和S11型斷裂蛋白質內含子Rma DnaB和Ssp GyrB，成功定點突變了N端或C端與剪接直接有關的保守位點的氨基酸，在E.coli

4、體內將其改造為只有一端可發(fā)生斷裂，不能進行完整的剪接作用的N端和C端切割元件。檢測改造后的斷裂蛋白質內含子一端切割的效率，篩選具高效切割活性的蛋白質內含子，以用于深入研究蛋白質剪接機制，以及進一步構建高效的蛋白純化系統(tǒng)。
　　 將斷裂蛋白內含子的N端和C端一小段多肽共同表達形成一個融合蛋白(NC蛋白)，同時在另一系統(tǒng)中表達intein中間片段(IM蛋白)，成功構建了Rma DnaB和Ssp GyrB的NC融合蛋白和IM蛋白。分別

5、純化NC和IM蛋白后，在16℃，25℃，37℃條件下進行體外剪接反應，從而達到輔助斷裂蛋白質內含子兩端二聚化的目的。通過檢測反應結果，解開IN和IC特異性結合之謎。
　　 通過本論文的研究，在蛋白質內含子高級結構未知的情況下，篩選獲得高剪接活性的蛋白質內含子，完成了對蛋白質內含子功能的進化。并實現(xiàn)了斷裂蛋白質內含子的空間隔離，這對多個蛋白質片段的體外連接具有重要的指導作用，并為研究蛋白質內含子剪接過程的可控性奠定理論基礎。隨著對